Daniela Berg

• 1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.…
• 2. Summary Variants of soluble human TRAIL (hTRAIL), encompassing solely the TNF-homology domain (THD), interact with TRAILR1 and TRAILR2, but they only stimulate TRAILR1 robustly. After crosslinking however, these ligands are also able to activate TRAILR2. Contrarily, the corresponding murine TRAIL variants poorly bind and activate their receptors even after crosslinking. Interestingly, a fusion protein consisting of the THD of mTRAIL and the trimerization domain of Tenascin-C (TNC) shows an effictive receptor binding and TRAILR2 activation2. Summary Variants of soluble human TRAIL (hTRAIL), encompassing solely the TNF-homology domain (THD), interact with TRAILR1 and TRAILR2, but they only stimulate TRAILR1 robustly. After crosslinking however, these ligands are also able to activate TRAILR2. Contrarily, the corresponding murine TRAIL variants poorly bind and activate their receptors even after crosslinking. Interestingly, a fusion protein consisting of the THD of mTRAIL and the trimerization domain of Tenascin-C (TNC) shows an effictive receptor binding and TRAILR2 activation after crosslinking. A variant of mTRAIL that not only contains the THD, but also the the stalk region, which seperates the transmembranedomain from the THD, does also induce apoptosis after crosslinking, but not as effective as the TNC-mTRAIL fusionprotein. The activity of soluble human TRAIL variants is also enhanced after fusion with TNC. It seems that especially for mTRAIL the spatial fixation of the THD by TNC is necessary for proper receptor binding and activation. This spatial fixiation is otherwise ensured by the stalk region or the transmembrane-domain. So the stalk region has unanticipated functions for the activity of the TNF ligands. Moreover, there is now an option to generate soluble ligands of the TNF-family with improved activity. TRAIL-induced apoptosis could be applied in the treatment of tumor cells. However, it was shown that TRAIL cannot only induce apoptosis, but also activates proinflammatory potentially tumor promoting pathways, especially in apoptosis resistant cells. Therefore, the ability of TRAIL to activate such pathways in myeloma cells was analyzed. Oligomerized TRAIL induces apoptosis and caspase activation in all analyzed myeloma cells. In experiments with the pan-caspase inhibitor ZVAD caspase acitvation could be blocked in all cell lines, but apoptosis could be blocked only in two cell lines. Three other myeloma cell lines were only marginally rescued from apoptosis. Therefore, TRAIL can also induce caspase independent cell death in myeloma cells. Beside apoptosis TRAIL also stimulates proinflammatory pathways like the NFкB-, the JNK, the p38- and the p42/44- pathway. Thereby, the activation of the NFкB- and p42/44-pathways is always caspase-dependent, but the induction of the p38- and JNKpathways is cell type specifically caspase-dependent. Thus, taken together for myeloma therapy TRAIL should be used in combination with anti-proinflammatory drugs to avoid potential side effects related to the proinflammatory properties of TRAIL.…