Matthias Seibl

• In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die inIn der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein.…
• The focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material wasThe focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material was available and which were embedded in routine procedures as well as coloured according to a standard approach. The SHARP-Screening compromises two complementary steps: The first step is the creation of a gene pool of all bacterial genes of the entire DNA extracted from the analysed tissue by the systematic amplification of the 16S-rRNA-gene by means of universal eubacterial primers. The next step after the transformation was the selection of the different phylotypes of the incorporated 16S-rRNA-genes (altogether 400) by analysing the restriction fragment length polymorphism (RFLP). After the sequencing, the 16S-rRNA-genes were identified by comparing them with the known bacterial sequences with help of the “Basic-Local-Alignment-Search-Tool” (BLAST). The SHARP-Screening has proved itself as an adequate method to analyse the entire bacterial flora contained in the tissue sample. In some cases different causative organisms were found in contrast to the expectations which arose from the histological pictures. In this way evidence of gluconacetobacter sacchari could be provided as potential causative agents of a septic granulomatosis, an alternative differential diagnosis to the histologically assumed cat scratch disease. Furthermore, histological pictures of a similar type could be observed with regard to the same identified causative organism. For example, in conjunction with the appearance of edema, necrosis, granulomatosic purulent alterations and a very pronounced sinushistiozytosis in the lymph node tissue, comamonadaceae and accordingly janthinobacteria could consistently be demonstrated. A lot of times not just a single causative organism but a whole spectrum of the lymphadenitis could be identified. Here, however, the existence of the 16S-rRNA cannot be attributed to the existence of vital causative agents. Nevertheless, the frequency of the respective clones allows a semi quantitative assessment of the importance of the corresponding causative agents. Thus the SHARP-Screening proved evidence of homologies to paracoccus yeeii. A species which is often missed with classic methods however can play a pathogenic role. In several cases streptomyces, roseomonas gilardii rosea and stenotrophomonas maltophila, which are often mentioned in literature with regard to immunosuppressed patients, could be demonstrated in connection with the histological suspicion of a malignant tumour. While suspecting a lymphgranuloma venerum, a cyanobacterium species was discovered which according to literature sources enables chlamydia trachomatis to operate the body’s amino acid metabolism. Altogether, the SHARP-Screening is expected to lead to even more profound findings of bacterial diversity and causal causative organism associations with regard to diseases of the lymphatic system.…