Regina Stoll

• Die PrfA-Aktivität im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivität beobachtet werden. In MMDie PrfA-Aktivität im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivität beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivität in Anwesenheit von Glycerin stark erhöht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-überexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivität gefunden. EGDΔprfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGDΔprfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivität. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erhöht die reduzierte PrfA-Aktivität in EGDΔprfApPrfA und in MM verstärkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivität des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabhängig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abhängig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabhängige Kohlenstoffquellen zur Verfügung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterstützt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich länger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei Stämmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivität mit der Expressionsstärke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenhängt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Domänen, der Membran überspannenden Zucker transportierenden Domäne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol löslichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empfängt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorgängen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren für alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren für 29 komplette und einige unvollständige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollständiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen möglichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivität zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche für putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bezüglich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivität untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erhöht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens für die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). Für den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollständigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser für die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazelluläre Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verhält es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte für Lmo0096 auch in Immunpräzipitationsassays gezeigt werden. Eine Überexpression von Lmo0096 führte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivität nach Wachstum in MM mit Glucose.…
• In this study the PrfA activity was assessed in L. monocytogenes strain EGD and its isogenic deletion mutant (EGDΔprfA) with the prfA or prfA* gene under the control of the prfA promoter located on the high copy plasmid pERL3 (strains EGDΔprfApPrfA and EGDΔprfApPrfA*) after growth in BHI, LB (Luria-Bertani broth) and defined minimal medium. Media were supplemented with 50 mM of the PTS carbon sources glucose, mannose or cellobiose or with the non-PTS carbon source glycerol. In the wild type EGD grown in BHI and LB a low PrfAIn this study the PrfA activity was assessed in L. monocytogenes strain EGD and its isogenic deletion mutant (EGDΔprfA) with the prfA or prfA* gene under the control of the prfA promoter located on the high copy plasmid pERL3 (strains EGDΔprfApPrfA and EGDΔprfApPrfA*) after growth in BHI, LB (Luria-Bertani broth) and defined minimal medium. Media were supplemented with 50 mM of the PTS carbon sources glucose, mannose or cellobiose or with the non-PTS carbon source glycerol. In the wild type EGD grown in BHI and LB a low PrfA activity was observed with all of the above carbon sources. In MM PrfA activity was strongly increased in the presence of glycerol and strongly decreased with cellobiose as sole carbon source. In the PrfA* overexpressing strain EGDΔprfApPrfA* high PrfA activity was detected under all conditions. EGDΔprfApPrfA exhibited a high activity only in BHI, though PrfA amounts were equally high as in EGDΔprfApPrfA*. Addition of the amberlite XAD4 to LB increases the reduced PrfA activity in EGDΔprfApPrfA and the activity of the wildtype in MM. A ptsH mutant is unable to grow in LB and MM irrespective of the supplementation with the four carbon sources (Stoll et al., 2008), indicating that the uptake of the carbon source used as well as the glycerol metabolism are dependent on an intact PTS pathway. In contrast, BHI obviously possesses PTS independent carbon sources, as the ptsH mutant is still able to grow in BHI. This is also confirmed by the fact that L. monocytogenes generation times are significantly longer in LB and even more in MM as compared to BHI. Expression of the PTS genes was assessed in all three strains upon different growth conditions. The data suggest that PrfA activity is correlated with the expression level and the phosphorylation state of specific PTS permeases. PTS permeases always consist of at least three domains, the membrane crossing sugar transporting domain EIIC (and EIID in mannose specific PTS) and the two cytosolic components EIIA and EIIB. EIIA is directly phosphorylated by HPr-His-P which receives its phosphate group from EI which is phosphorylated by PEP. Aside from sugar transport PT Systems are involved in a variety of regulatory processes in the bacterial cell, e.g. in pathogenesis (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listeria code for all of the seven known PTS families with 86 genes coding for 29 complete and several incomplete PTS. Despite the large number of PTS genes L. monocytogenes does not possess a complete PtsG homologue to E. coli or B. subtilis but only an orphan EIIAGlc. To identify the PTS permeases involved in glucose uptake and to investigate a possible role in PrfA regulation, mutants with deletions of beta glucoside PTS (PTSGlc), mannose PTS (PTSMan) and cellobiose PTS (PTSLac) permeases have been analyzed systematically in this study. These deletion mutants were analyzed in respect to their growth upon the respective PTS sugars and to their PrfA activity. Deletion of the five PTSGlc permeases only weakly expressed in L. monocytogenes EGD-e had no impact on growth in MM with 10 mM glucose or cellobiose. At least two out of the four expressed PTSMan permeases are able to transport glucose and the deletion of these PTS (encoded by lmo0096-0098 and lmo0781-0784) causes a significant increase in expression of the PTSGlc(lmo0027) permease, which is expressed at a low level in the wildtype. For transport of cellobiose, only PTSLac(lmo2683-2685) out of the six complete PTSLac permeases and, after deletion of this operon, PTSGlc(lmo0027) seem to be of importance. Although multiple deletions of the PTS important for glucose/mannose and cellobiose uptake have severe consequences on growth in defined MM, obviously intracellular life is not affected, as infection rates resemble those of the wild type. PrfA is activated by the stepwise deletion of the glucose/mannose specific PTS upon growth in MM supplemented with glucose, but no effect is seen upon growth in cellobiose supplemented MM. The behavior of the PTSLac deletion mutants is conversely. In vitro transcription studies with (partially phosphorylated) purified Lmo0096 (EIIABMan) and Lmo1017 (EIIAGlc) proteins suggest a direct interaction between PrfA and specific EII proteins. This could be confirmed for Lmo0096 in immuno precipitation assays. An overexpression of lmo0096 lead to a significant reduction of PrfA activity upon growth in MM supplemented with glucose.…