Maher Othman Sholkamy Eman

• Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) andHyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial.…
• Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein),Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein), HK2-Zellen (humane Nierenzellen) und peripheren humanen Lymphozyten. Um die Gentoxizität von Insulin zu bestätigen, wurden auch andere Zellen aus unterschiedlichen Geweben untersucht. Um sicherzustellen, dass die Effekte durch Insulin nicht auf permanente Zelllinien beschränkt sind, wurden außerdem primäre Rattenzellen aus Dickdarm, Niere, Leber und Fettgewebe untersucht. Um die Befunde auf die in-vivo-Situation übertragen zu können, kamen zwei Hyperinsulinämie-Modelle zum Einsatz: mit Insulin infundierte ZDF-Ratten (Zucker Diabetic Fatty Rats) und periphere Lymphozyten von Patienten mit Diabetes Typ 2. Zuerst konnte in humanen Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT29) eine signifikante Erhöhung des DNA-Schadens in Standard-Protokollen des Comet Assays und des Mikrokerntests nach Behandlung mit 5 nM Insulin gezeigt werden. Bei Verlängerung der Behandlungszeit auf 6 Tage wurden signifikante Effekte bereits ab 0,5 nM beobachtet. Insulin erhöhte die zelluläre ROS-Produktion, die als Oxidation der Farbstoffe 2‘,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCF-DA) und Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen wurde. Befunde aus dem FPG-modifizierten Comet Assay und das Ergebnis, dass der Radikalfänger Tempol die Zellen schützte stellen die Verbindung zwischen Insulin-verursachtem DNA-Schaden und ROS produktion her. Um die ROS-Quelle nach Stimulation mit Insulin zu untersuchen, wurden Apocynin und VAS2870 als NADPH-Oxidase-Inhibitoren und Rotenon als Inhibitor der Mitochondrien mit Insulin kombiniert. Alle diese Stoffe reduzierten den Genomschaden. Zur Charakterisierung der Signalwege wurde zunächst die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor und an den IGF1-Rezeptor untersucht. Beide Rezeptoren sind an der Signaltransduktion beteiligt. Nach Aktivierung der Rezeptoren wird die PI3K aktiviert, dies führt zur Phosphorylierung von AKT. Dadurch werden zwei Wege zur ROS-Produktion aktiviert, der erste involviert die mitochondriale Atmungskette , der zweite agiert durch Rac1-Aktivierung. Letzteres resultiert in der Aktivierung der NADPH-Oxidase Isoform Nox1. Der Effekt von Insulin auf zelluläres Chromatin konnte in einer weiteren humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie und in primären Dickdarmzellen der Ratte in vitro bestätigt werden. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass pathophysiologische Insulin-Blutspiegel DNA-Schäden im Dickdarm verursachen können. Dies könnte zur Induktion oder Progression von Dickdarmkrebs beitragen. Weiterhin verursachte Insulin bei einer Konzentration von 5 nM einen signifikanten Anstieg von DNA-Schäden in vitro. Dies war verbunden mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bei Anwesenheit von Antioxidantien, von Inhibitoren des Insulin-Rezeptors bzw. des IGF-1-Rezeptors und eines Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Inhibitors war der Insulin-vermittelte DNA-Schaden reduziert. Phosphorylierung von AKT war erhöht und das Protein P53 akkumulierte. Inhibierung der ROS-Produktion der Mitochondrien bzw. der NADPH-Oxidase reduzierte den Insulin-vermittelten Schaden. In primären Rattenzellen induzierte Insulin ebenfalls Genomschaden. HK2-Zellen wurden zur Untersuchung der mechanistischen Signalwege in der Niere eingesetzt. Die Signalwege entsprechen denen der Dickdarmzellen bis zur Aktivierung der ROS-Produktion in den Mitochondrien. Als Folge der Aktivierung von PI3K wird Nox4 aktiviert. Eine Verbindung zwischen Mitochondrien und Nox4-Aktivierung wird vorgeschlagen. Als in-vivo-Modell wurden gesunde ZDF-Ratten mit Insulin infundiert, um normale bzw. erhöhte Insulin-Blutspiegel bei konstanten Glukose-Blutspiegeln zu erreichen. In den Nieren war der Gehalt an ROS und an P53 in der Gruppe mit erhöhten Insulin-Blutspiegeln im Vergleich zur Kontrolle erhöht. ROS und P53 waren ebenfalls in den diabetischen und adipösen ZDF-Ratten erhöht. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit Metformin reduzierte die DNA-Oxidation, die in Form von 8-oxodG bestimmt wurde, und die ROS-Produktion in dieser Gruppe. HL60-Zellen und kultivierte Lymphozyten als Modelle für das hämatopoetische System zeigten eine signifikante Induktion von DNA-Schäden nach Behandlung mit Insulin. Diabetes-Patienten zeigten eine erhöhte Mikrokern-Bildung im Vergleich zu gesunden Probanden. In der vorliegenden Studie konnten wir erstmals zeigen, dass Insulin-induzierter oxidativer Stress zu Genomschaden führt, und dass in unterschiedlichen Geweben ROS aus verschiedenen Quellen stammten. Falls diese Mechanismen auch in Patienten auftreten, könnte Hyperinsulinämie durch ROS-Induktion zu Genomschaden führen und damit zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Unter bestimmten Bedingungen könnten Antioxidantien bzw. Inhibitoren der Mitochondrien oder der NADPH-Oxidase protektive Effekte ausüben.…