Justyna Joanna Jaślan

• In contrast to the well described molecular basis for S-type anion currents, the genes underlying R-type anion currents were unknown until 2010. Meyer S. and colleagues (2010) showed that, localized in the guard cell plasma membrane, AtALMT12 is an R-type anion channel involved in stomatal closure. However, knocking out AtALMT12 did not fully shut down R-type currents; the almt12 loss-of-function mutant has residual R-type-like currents indicating that ALMT12 is not the only gene encoding Arabidopsis thaliana R-type channels (Meyer S. et al.,In contrast to the well described molecular basis for S-type anion currents, the genes underlying R-type anion currents were unknown until 2010. Meyer S. and colleagues (2010) showed that, localized in the guard cell plasma membrane, AtALMT12 is an R-type anion channel involved in stomatal closure. However, knocking out AtALMT12 did not fully shut down R-type currents; the almt12 loss-of-function mutant has residual R-type-like currents indicating that ALMT12 is not the only gene encoding Arabidopsis thaliana R-type channels (Meyer S. et al., 2010). This PhD thesis is focussed on understanding the properties, regulation and molecular nature of the R-type channels in Arabidopsis thaliana plants. To fulfil these aims, the patch clamp technique was used to characterize electrical features of R-type currents in various conditions such as the presence/absence of ATP, variation in cytosolic calcium concentration or the presence of cytosolic chloride. Electrophysiological study revealed many similarities between the features of Arabidopsis thaliana R-type currents (Col0) and residual R-type currents (the almt12 loss-of-function mutant). Strong voltage dependency, channel activity in the same voltage range, position of maximal recorded current and blockage by cytosolic ATP all pointed to a shared phylogenetic origin of the channels underlying these R-type currents. Expression patterns of the ALMT family members for Col0 and the almt12 mutant revealed ALMT13 and AMT14 as potential candidates of the R-type channels. Electrical characterization of Col0, almt12 and the two double loss-of-function mutants (almt12/almt13 and almt12/almt14) strongly suggest that ALMT13 mediates the calcium-dependent R-type current component that is directly regulated by cytosolic calcium. Additionally, similarly to ALMT12, ALMT14 could participate as a calcium-independent R-type anion channel. Differences in response to the cytosolic calcium concentration between ALMT12, ALMT13 and ALMT14 suggest their possible involvement in different signalling pathways leading to stomatal closure. Moreover, a study performed for the two Arabidopsis thaliana ecotypes Col0 and WS showed drastically increased ALMT13 expression for WS, which is related to R-type current properties. The WS ecotype has calcium-dependent R-type current behaviour, while it is calcium-independent in Col0. Furthermore, this plant line showed lower peak current densities compared to Col0 and almt mutants. These facts strongly suggest interaction between ALMT12 and ALMT13, with ALMT13 as a repressor of the ALMT12. Acquired patch clamp data revealed sulphate-dependent increases in ALMT13 current. This could be caused by changes in absolute open probability and/or permeability for sulphate and possibly chloride and links ALMT13 with sulphate-mediated stomatal closure under drought stress. It was then confirmed that ATP affects R-type currents. In contrast to Vicia faba, ATP was identified as a negative regulator of the Arabidopsis thaliana R-type anion channels. The effect of ATP is ambiguous but there is a high probability that it is a result of direct block and phosphorylation. However, the phosphorylation site and place of ATP binding needs further investigation. The story of the ALMT family, as examined in this thesis, sheds light on the complexity of the stomatal closure process.…
• Im Gegensatz zu den gut beschriebenen S-Typ Anionenströmen, die durch Kanäle der SLAC1 Familie vermittelt werden, waren die Gene, die für R-Typ Anionenkanäle kodieren bis 2010 unbekannt (Negi J. et al., 2008, Vahisalu T. et al., 2008). In diesem Jahr identifizierten Meyer S. und Kollegen AtALMT12 als R-Typ Anionenkanal, der in der Plasmamembran von Schließzellen lokalisiert und am Stomaschluss beteiligt ist. In almt12 Verlustmutanten sind jedoch restliche R-Typ Ströme messbar, die darauf hinweisen, dass ALMT12 nicht das einzige Gen ist, dasIm Gegensatz zu den gut beschriebenen S-Typ Anionenströmen, die durch Kanäle der SLAC1 Familie vermittelt werden, waren die Gene, die für R-Typ Anionenkanäle kodieren bis 2010 unbekannt (Negi J. et al., 2008, Vahisalu T. et al., 2008). In diesem Jahr identifizierten Meyer S. und Kollegen AtALMT12 als R-Typ Anionenkanal, der in der Plasmamembran von Schließzellen lokalisiert und am Stomaschluss beteiligt ist. In almt12 Verlustmutanten sind jedoch restliche R-Typ Ströme messbar, die darauf hinweisen, dass ALMT12 nicht das einzige Gen ist, das in Arabidopsis thaliana für R-Typ Anionenkanäle kodiert (Meyer S. et al., 2010). Diese Dissertation konzentriert sich auf die Analyse der Eigenschaften, der Regulation und der molekularen Natur der R-Typ Kanäle in Arabidopsis thaliana Pflanzen. Dafür wurde die Patch Clamp Technik angewandt, um den Einfluss verschiedener Faktoren wie z.B. das Fehlen/Vorhandensein von ATP, Unterschiede in der zytosolischen Kalziumkonzentration oder das Vorhandensein von zytosolischem Chlorid auf die elektrische Eigenschaften der R-Typ Ströme der verschiedene Kanäle zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Untersuchungen zeigten viele Ähnlichkeiten zwischen den Eigenschaften von R-Typ Ströme in Wildtyp Pflanzen (Col0) und den noch vorhandenen Strömen in der Verlustmutante almt12. Beide sind stark spannungsabhängig, zeigen Kanalaktivität im gleichen Spannungsbereich und werden durch zytosolisches ATP inhibiert, was auf einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung der R-Typ Anionenkanäle hinweist. Die Expressionsanalyse der Gene der ALMT-Familie zeigte, dass ALMT13 und ALMT14 weitere potenzielle Kandidaten für Anionenkanäle des R-Typs sind. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Col0, almt12 und den beiden zweifachen Verlustmutanten almt12/almt13 und almt12/almt14 ermöglichte es, die durch ALMT13 vermittelten Ströme als kalziumabhängige Komponente der R-Typ Ströme zu spezifizieren. Dabei wird ALMT13 direkt durch zytosolisches Kalzium reguliert. ALMT14 vermittelt dagegen kalziumunabhängige Ströme, ähnlich wie ALMT12. Unterschiede in der Reaktion auf die zytosolische Kalziumkonzentration zwischen ALMT12, ALMT13 und ALMT14 deuten auf eine mögliche Beteiligung an verschiedenen Signalwegen hin, die zum Stomaschluss führen. Darüber hinaus wurde eine Studie für zwei Arabidopsis thaliana Ökotypen durchgeführt. Pflanzen des Ökotyps WS zeigten eine erhöhte Expression von ALMT13 im Vergleich zu Col0 Pflanzen, während die Expression von ALMT12 in beiden vergleichbar ist. Diese Unterschiede wirken sich auf die R-Typ Ströme aus, die nur in WS-Pflanzen kalziumabhängig sind und eine geringere Amplitude haben. Diese Fakten deuten stark auf eine Interaktion zwischen ALMT12 und ALMT13 hin, bei der ALMT13 als Repressor von ALMT12 wirkt. Die Auswertung der Patch-Clamp-Daten zeigte außerdem eine sulfatabhängige Zunahme der durch ALMT13 vermittelten R-Typ Ströme. Diese wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Offenwahrscheinlichkeit und/oder der Permeabilität für Sulfat und möglicherweise für Chlorid verursacht, und die darauf hinweist, dass ALMT13 für frühe Antworten im sulfatvermittelten Stomaschluss bei Trockenstress eine Rolle spielt. Außerdem wurde gezeigt, dass ATP die R-Typ Ströme beeinflusst. In Arabidopsis thaliana Pflanzen wirkt ATP als negativer Regulator der Anionenkanäle vom R-Typ, nicht jedoch in Vicia faba (Hedrich R. et al., 1990). Der Mechanismus, über den ATP wirkt ist nicht eindeutig geklärt, aber es wird davon ausgegangen, dass es sich um eine direkte Inhibierung und Phosphorylierung handelt. Die Phosphorylierungsstelle und der Ort der ATP-Bindung bedürfen jedoch weiterer Untersuchungen. Die Geschichte der ALMT-Familie, wie sie in dieser Arbeit untersucht wird, wirft ein Licht auf die Komplexität des stomatalen Verschlussprozesses.…