Ana Gabriela Sitaru

• Transplantation is now firmly established as a therapeutic approach to extend and improve the life of patients in the final stages of organ failure. It has been demonstrated that transplantation between genetically non-identical individuals leads to the activation of the recipient’s alloimmune response as a major determinant of transplant outcome. T cell recognition of foreign MHC molecules plays a key role in initiating and sustaining allograft rejection. To prevent the risk of rejection, patients are given immunosuppressive drugs, which areTransplantation is now firmly established as a therapeutic approach to extend and improve the life of patients in the final stages of organ failure. It has been demonstrated that transplantation between genetically non-identical individuals leads to the activation of the recipient’s alloimmune response as a major determinant of transplant outcome. T cell recognition of foreign MHC molecules plays a key role in initiating and sustaining allograft rejection. To prevent the risk of rejection, patients are given immunosuppressive drugs, which are non-specific and have major side-effects (infections, malignancies). It has been shown that the alloreactive T cells specifically recognize donor MHC-derived peptides. This implies that it may be possible to develop antigen-specific strategies in order to modulate the alloimmune response by peptide analogues and specifically altered peptide ligands. The purpose of this study was to explore the potential of “recipient-adapted” analogues from the dominant MHC class I peptide to modulate the alloimmune response. Beside the significant role of donor dominant determinants in the rejection process, we tested seven 13-to-24-mer peptides from the Wistar-Furth MHC class I molecule (WF, RT1.Au) for their possible immunogenicity in a fully MHC-mismatched WF to Lewis (LEW, RT1l) rat strain combination. Secondly, the immunodominant allopeptide was selected to generate analogues in order to investigate their modulatory capacity. All peptides were tested in vitro in a standard proliferation assay and in vivo using a heterotopic heart transplantation model. Our findings show that five peptides (P1-P5) were able to induce specific T cell proliferation in LEW responders. Furthermore, we found a hierarchical distribution of the determinants: peptide P1 as a good candidate for the immunodominant determinant, while P2, P3, P4, and P5 as subdominant epitopes and the other two peptides, P6 and P7, as non-immunogenic determinants of WF MHC class I molecule. Furthermore, the dominance of P1 was confirmed by the strong proliferation induced after immunization with a mixture of peptides in the presence of P1. This hierarchical distribution of the proliferative response correlated with the cytokine production. Peptide P1, comprising only 3 allogeneic amino acids (L5, L9, and T10) induced the strongest T cell proliferation and produced high levels of cytokines, especially IL-2 and IFN-g. In addition, the immunodominance of peptide P1 was confirmed by the significant reduction in the allograft survival time in comparison to the non-immunized control animals. Since the TCR Vß repertoire of rejected graft-infiltrating cells in rejected allografts was similar to the profile observed after in vitro restimulation of P1-primed T cells, we concluded that peptide P1 is able to activate the alloreactive T cell population. Our results demonstrate the particular role of the dominant peptide P1 (residues 1-19) in the allograft rejection in WF to LEW rat strain combination. In the second set of experiments, we investigated the fine specificity of the dominant peptide P1-activated T cells using peptide analogues from P1. The “recipient-adapted” analogues were designed by changing the allogeneic RT1.Au amino acids (L5, L9, T10) one-by-one with the correspondent syngeneic RT1.Al amino acids (M5, D9, I10) in the sequence of peptide P1. The six peptide analogues (A1.1-A1.6) consisting of either one or two allogeneic amino acids were able to induce a specific T cell proliferative response and cytokine production. Analogue A1.5 with only one allogeneic amino acid (L5) was of particular interest because it induced a low T cell proliferation and high cytokine levels, especially IL-4 and IL-10. In addition, immunization with A1.5 did not influence the allograft survival time in comparison to the non-immunized LEW recipients. A1.5 was the only analogue able to down-regulate the proliferation of P1-primed T cells. Our results reveal that A1.5 is an MHC competitor as confirmed by the in vitro MHC competition assay and the inhibition of the negative effect of P1 on the allograft survival time when recipients were immunized with a mixture of P1 and A1.5. These findings suggest that it is possible to design peptide analogues, such as A1.5, which do not stimulate the dominant peptide P1-specific T cell population and even more, are able to block its presentation in the MHC molecule. In all, the results indicate that the specific suppression of indirect allorecognition can be achieved by using peptide analogues of the dominant allopeptide.…
• Ursache der Transplantatabstoßung ist in erster Linie die genetische Differenz im Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) zwischen Transplantatspender und Empfänger. Dabei stellen die aus den Fremd-MHC-Molekülen durch empfänger-eigene antigenpräsentierende Zellen prozessierten MHC-Peptide einen wichtigen Stimulus zur Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten des Transplantat empfängers dar. Für die Transplantation bedeutsam ist, dass sowohl diese, als auch synthetische MHC-Peptide, wenn sie die genetische Differenz zwischen einer bestimmtenUrsache der Transplantatabstoßung ist in erster Linie die genetische Differenz im Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) zwischen Transplantatspender und Empfänger. Dabei stellen die aus den Fremd-MHC-Molekülen durch empfänger-eigene antigenpräsentierende Zellen prozessierten MHC-Peptide einen wichtigen Stimulus zur Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten des Transplantat empfängers dar. Für die Transplantation bedeutsam ist, dass sowohl diese, als auch synthetische MHC-Peptide, wenn sie die genetische Differenz zwischen einer bestimmten Spender-Empfänger-Kombination repräsentieren, die Alloimmunantwort induzieren und damit die Abstoßung fördern. Das Ziel dieser Arbeit war, dass bereits in zahlreichen Experimentalmodellen für Autoimmunerkrankungen erfolgreiche Konzept der antigenspezifischen Immuntherapie mit Peptidvarianten oder altered peptide ligands auf die Transplantation zu übertragen. Anders als bei Autoimmunerkrankungen basiert die Alloimmunantwort aber nicht auf ein einyelnes Peptidantigen und darüber hinaus beeinflußt die jeweilige Spender-Empfänger-Kombination sehr stark dieses Peptidantigen-Repertoire. Um die Frage zu klären, welche der potentiellen MHC-Peptidantigene in der Alloimmunaktivierung dominieren, wurden Untersuchungen im Nagermodell für die allogene Spender-Empfänger-Kombination Wistar-Furth (WF, RT1u) und Lewis (LEW, RT1l) durchgeführt. Für die Transplantation wird erwartet, dass solche gezielt hergestellten Peptidvarianten sowohl die Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten als auch weitere Funktionen, wie z. B. die Produktion von Cytokinen, hemmen. Dieser antigenspezifische, und wahrscheinlich auch nebenwirkungsfreie Therapieansatz könnte möglicherweise zur langfristigen Erhaltung der Transplantatfunktion führen. Durch Vergleich der Sequenzen für das MHC-Klasse-I Molekül beider Ratten-Stämme wurden für die a1 und a2 Domäne - dies ist der extrazelluläre, für die Bindung von Peptiden unterschiedlichster Herkunft verantwortliche Bereich des Moleküls - insgesamt 34 Positionen identifiziert, in denen beide Stämme unterschiedliche Aminosäuren aufweisen. Diese Differenzen werden von sieben synthetischen, mit den entsprechenden Bereichen des Spender MHC-Klasse-I Moleküls identischen MHC-Peptiden repräsentiert, welche zwischen 13 und 24 Aminosäuren lang sind. Die immunstimulierende Wirkung dieser Peptide (P1 bis P7) wurde im Proliferationsassay und im Transplantationsmodell bestimmt. Ausschließlich das Peptid mit der Bezeichnung P1 induzierte mit über 20.000 cpm die stärkste, mit einen Th1-dominierten Cytokinmuster (IL-2 und IFN-g) einhergehende T-Zellproliferation. Lewis-Empfänger, die vor der Transplantation mit diesem Peptid immunisiert wurden, stießen ihre von WF-Spendern stammenden heterotopen Herztransplantate beschleunigt ab. Von sieben potentiellen Peptidantigenen induzierte somit ausschließlich Peptid P1 eine dominante Alloimmunaktivierung und erscheint als Peptidantigen zur Herstellung von Peptidvarianten prädestiniert. P1 weicht in drei Aminosäurepositionen von der entsprechenden Sequenz der Lewis-Ratte ab. Durch sequentiellen Austausch dieser drei in der WF-Sequenz befindlichen allogenen Aminosäuren durch die entsprechenden syngenen Aminosäuren in der LEW-Sequenz führte zu sechs Peptidvarianten. Diese Empfänger-angepassten Varianten A1.1 bis A1.6 wurden anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht, eine peptidspezifische T-Zellproliferation zu inhibieren, die möglicherweise mit einer protektiven Wirkung auf die Transplantatfunktion einhergeht. Von diesen Peptidvarianten induzierte nur Variante A1.5, sie besitzt noch eine allogene Aminosäure an Position 5, eine reduzierte T-Zellproliferation von 11.450 cpm, die mit einem Th2-dominierten Cytokinmuster (IL-4 und IL-10) korreliert. Zusätzlich hemmte A1.5 die Proliferation der P1-spezifischen T-Lymphozyten. Im Gegensatz zum Ausgangs-peptid P1 beeinflußte A1.5 nicht die Abstoßung heterotoper Herztransplantate und konnte, wurde es in Kombination mit P1 appliziert, die P1-induzierte Transplantatabstoßung verzögern. Um diese immunmodulatorische Fähigkeit der Variante A1.5 weiter zu untersuchen, wurde das Peptid in einem T-Zellrezeptor-Modulationsassay sowie in einem MHC-Kompetitionsassay getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass A1.5 nicht die T-Zellproliferation über den T-Zellrezeptor inhibiert, sondern über die verstärkte Bindung an das MHC-Klasse-II Molekül, wodurch das Peptid P1 wahrscheinlich aus der Bindungstasche verdrängt wird. Dieses Ergebnis wurde von weiteren in vivo Daten unterstützt. Wurden beide Peptide getrennt und nicht im Gemisch appliziert, konnte A1.5 die abstoßungsinduzierende Wirkung von P1 nicht mehr kompensieren, und das Transplantat wurde zum gleichen Zeitpunkt nach Transplantation abgestoßen wie in P1-immunisierten Tieren.…