Frank Galka

• Das Gram-negative Bakterium Legionella pneumophila ist der Haupterreger der humanen Legionärskrankheit, einer schweren atypischen Pneumonie. Aufgrund mangelnder Diagnostik bleibt L. pneumophila als Krankheitsverursacher jedoch oft unerkannt. Neuesten Schätzungen des Kompetenznetzwerkes für ambulant erworbene Pneumonien (CAPNETZ) zufolge könnten Legionellen in Deutschland für jährlich ca. 21 000 Pneumonien verantwortlich sein, etwa doppelt so viele Fälle wie bisher angenommen. Die Pathologie der humanen Infektion zeichnet sich durchDas Gram-negative Bakterium Legionella pneumophila ist der Haupterreger der humanen Legionärskrankheit, einer schweren atypischen Pneumonie. Aufgrund mangelnder Diagnostik bleibt L. pneumophila als Krankheitsverursacher jedoch oft unerkannt. Neuesten Schätzungen des Kompetenznetzwerkes für ambulant erworbene Pneumonien (CAPNETZ) zufolge könnten Legionellen in Deutschland für jährlich ca. 21 000 Pneumonien verantwortlich sein, etwa doppelt so viele Fälle wie bisher angenommen. Die Pathologie der humanen Infektion zeichnet sich durch extrazelluläre Effekte aus, für die in den letzten Jahren vielfältige sekretierte Effektormoleküle (SSPs) verantwortlich gemacht wurden. Darüber hinaus tragen spezielle Sekretionsmaschinen wie das Dot/Icm Typ-IV-Sekretionssystem sowie ersten Hinweisen entsprechend Membranvesikel, die von der äußeren Membran der Bakterien abgeschnürt werden (OMVs), zur intrazellulären Pathogenität von L. pneumophila bei. In der vorliegenden Dissertation bildet die umfassende Charakterisierung des Sekretoms von L. pneumophila den Schwerpunkt. Diese ist untergliedert in (i) Untersuchungen zur OMV-Produktion im Lebenszyklus von L. pneumophila, (ii) Proteomcharakterisierung der Sekretomfraktionen SSP und OMV und (iii) funktionale Analyse der Sekretomfraktionen. Für einen Beitrag von OMVs zur L. pneumophila-Pathogenese ist deren Produktion während extra- und intrazellulären Wachstums essentiell. Mit Hilfe verschiedener Mikroskopie-Techniken wird in dieser Dissertation gezeigt, dass die Abschnürung von OMVs sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in Legionella-spezifischen Phagosomen stattfindet und von einer intakten Bakterienmembran erfolgt. Des Weiteren werden OMVs nicht nur während der exponentiellen, sondern auch während der stationären Phase produziert. Diese Beobachtung ist bedeutend, weil sich L. pneumophila während der postexponentiellen Phase in die transmissive Form mit voller Virulenz differenziert und sich der Wechsel in die virulente Form folglich auch in der Zusammensetzung der OMVs widerspiegeln könnte. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Proteomanalyse der Sekretomfraktionen. Die Proteinidentifikation ergab 181 nicht-redundante Proteine im L. pneumophila-Sekretom, von denen 107 für die SSP-Fraktion und 33 für die OMV-Fraktion hochspezifisch sind. In beiden Fraktionen sind insgesamt 22 Typ-II-Sekretionssubstrate enthalten, die verschiedene degradierende Enzymaktivitäten aufweisen. Außerdem wurden 38 bisher putative Typ-II-Substrate, 3 Typ-IV-Substrate und 7 Eukaryoten-ähnliche Proteine detektiert. Die Analyse der Verteilung der Proteine zeigt, dass der prozentuale Anteil der „Virulenz-/Pathogenese“-Proteine in der OMV-Fraktion mit 24% gegenüber 11% in der SSP-Fraktion mehr als doppelt so hoch liegt. Acht Faktoren, u. a. das Mip-Protein, einer der Haupt-Virulenzfaktoren von L. pneumophila, sind nur auf OMVs beschränkt. Dies könnte darauf hindeuten, dass OMVs als spezifische Transportmittel für Virulenz-assoziierte Effektoren dienen. In der funktionalen Analyse der SSP- und OMV-Fraktionen wurden anhand verschiedener Techniken Aspekte untersucht, die während des Infektionsprozesses eine Rolle spielen. Dabei zeigt sich, dass SSPs und OMVs proteo- und lipolytische Enzymaktivitäten besitzen, die zur Zerstörung der Alveolaroberfläche, zur Transmigration der Bakterien durch Lungenepithelbarriere und Basallamina und letztendlich zur Ausbreitung von L. pneumophila im Lungengewebe und zur Milz beitragen könnten. Jedoch konnten für OMVs keine naheliegenden zytotoxischen oder zytolytischen Eigenschaften nachgewiesen werden. In Alveolarepithelzellen können sie ein spezifisches Zytokinsekretionsprofil induzieren, was ihre modulierenden Effekte auf Wirtszellen bestätigt. Die gezeigte Bindung von OMVs an Alveolarepithelzellen bildet die Voraussetzung für eine Interaktion mit den Wirtszellen. Ob dabei eine Fusion mit der Zytoplasmamembran und ein möglicher Transfer von Effektoren in die Wirtszelle stattfinden, bleibt zu klären. Abschließend werden diskutierte Funktionen sekretierter OMVs während der L. pneumophila-Infektion in einem Modell zusammengefasst. Diese neuen Ergebnisse zum Proteom des Sekretoms und zur Funktion von L. pneumophila-OMVs tragen zum besseren Verständnis der Interaktion von L. pneumophila mit seiner Umwelt und der Pathogenese bei. Gleichzeitig liefern sie eine wichtige theoretische Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten über Interaktionsprozesse und beteiligter Effektoren, deren tiefgreifendes Verständnis die Vorraussetzung für die Entwicklung neuer Strategien in der Therapie von Legionella-Infektionen bildet.…
• The Gram negative bacterium Legionella pneumophila is the aetiological agent of Legionnaires’ disease, a severe atypical form of pneumonia. Due to poor diagnostics, in many cases L. pneumophila is not detected as causative organism. According to recent evaluations of the “Kompetenznetzwerkes für ambulant erworbene Pneumonien” (CAPNETZ), Legionella might be responsible for ca. 21.000 pneumonia every year in Germany, which is twice as much as originally estimated. Massive extracellular damages are typical features of the pathology during humanThe Gram negative bacterium Legionella pneumophila is the aetiological agent of Legionnaires’ disease, a severe atypical form of pneumonia. Due to poor diagnostics, in many cases L. pneumophila is not detected as causative organism. According to recent evaluations of the “Kompetenznetzwerkes für ambulant erworbene Pneumonien” (CAPNETZ), Legionella might be responsible for ca. 21.000 pneumonia every year in Germany, which is twice as much as originally estimated. Massive extracellular damages are typical features of the pathology during human infection, for which secreted effector molecules (SSPs) have been made responsible. Moreover, recent studies demonstrated that sophisticated secretion machineries like the Dot/Icm type-IV secretion system as well as membrane vesicles, which are pinched off the outer bacterial membrane (OMVs), can contribute to intracellular pathology of L. pneumophila. The present thesis deals with the comprehensive characterisation of the L. pneumophila secretome and is subdivided in (i) examinations on OMV production during the L. pneumophila life cycle, (ii) proteome characterisation of secretome fractions SSP and OMV, and (iii) functional analysis of the secretome fractions. To contribute to L. pneumophila pathogenesis, the production of OMVs during extra- and intracellular growth is essential. By applying various microscopical techniques it is shown that OMVs are pinched off from an intact bacterial membrane when residing extracellularly as well as intracellularly in Legionella-specific phagosomes. Moreover, OMVs are produced during exponential and stationary phase. This observation is of relevance as L. pneumophila differentiates into the transmissive form, which owns full virulence traits, during the post-exponential phase. Consequently, the transformation into the virulent form might be reflected in the composition of OMVs. The second section deals with the proteome analysis of secretome fractions. The protein identification resulted in 181 non-redundant L. pneumophila secretome proteins, of which 107 are highly specific for the SSP fraction and 33 for OMVs, respectively. Both fractions contain a total of 22 type-II secretion substrates which exhibit various degradative enzyme activities. Furthermore, 38 so far putative type-II substrates, 3 type-IV substrates and 7 eukaryotic-like proteins were detected. The analysis of the distribution of proteins demonstrates that the percentage of virulence-/pathogenicity-involved proteins differs heavily between 24% at the OMV fraction and 11% at the SSP fraction. Eight factors including Mip, which is one of the main virulence factors of L. pneumophila, were unique to OMVs. This suggests that OMVs might serve as specifc carriers for virulence-associated effectors. In the functional analysis of SSP and OMV fractions several techniques were applied to highlight aspects which play a role during the infection process. The results show that SSPs and OMVs possess proteolytic and lipolytic enzyme activities which might contribute to the destruction of the alveolar surface, the transmigration of bacteria through the lung epithelial barrier and the basal lamina, and finally to the dissemination of L. pneumophila in the lung tissue and to the spleen. However, neither cytotoxic nor cytolytic activities were observed for OMVs. In alveolar epithelial cells OMVs are able to induce a specific cytokine secretion profile, confirming their modulatory effects on host cells. The demonstrated bindung of OMVs on alveolar epithelial cells is the precondition for an interaction with host cells. Whether OMVs fuse with cytoplasmic membranes or transfer effector molecules into the host cell remains to be established. Finally, discussed functions of secreted OMVs during L. pneumophila infection are combined in a model. These results on the secretome proteome and the functions of L. pneumophila OMVs contribute to a better understanding of the interaction of L. pneumophila with its environment and of pathogenesis. At the same time the data provide an important theoretical basis for future studies on interaction processes and involved effectors, whose comprehensive understanding is required for the development of novel strategies in the therapy of Legionella infections.…