Antje [geb. Koppelkamm] Huth

• Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erhöhtem Postmortalintervall und somit möglicherweise verminderter RNA-Integrität realisierbar sind und in Zukunft als zusätzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden können. Dafür wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verlässlichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen können. Es konnte zunächst fürDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erhöhtem Postmortalintervall und somit möglicherweise verminderter RNA-Integrität realisierbar sind und in Zukunft als zusätzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden können. Dafür wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verlässlichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen können. Es konnte zunächst für postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erhöhtem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrität der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gewählten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe für Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrität und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der größten postmortalen Transkriptstabilität identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verlässliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene können auch zukünftig für quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten ähnelt. Für die Todesursache sowie für den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilitäten möglicher Kontrollgene zu erklären. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erhältlicher RNA für jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualitätsprüfung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs möglich, in dem ein verändertes Expressionslevel tatsächlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressionsänderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorgetäuscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zukünftigen Studien nur Proben mit ähnlichen Integritäten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen Körper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und können interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext ergänzende Hinweise auf die Diagnose liefern könnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gewählten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine überraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als mögliche Ursache für diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilität infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zusätzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einführung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis für die verlässliche Durchführung künftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe.…
• Using quantitative gene expression studies could form a valuable innovative tool for the determination of the cause of death in forensic pathologies. Thus, the present work focuses on the questions around the possibilities and limitations of gene expression analysis in postmortem human tissue from donors with prolonged postmortem interval (PMI) and probably decreased RNA integrity. Therefore several parameters influencing the reliability of quantitative gene expression data were examined. First, it was found that in postmortem skeletal muscleUsing quantitative gene expression studies could form a valuable innovative tool for the determination of the cause of death in forensic pathologies. Thus, the present work focuses on the questions around the possibilities and limitations of gene expression analysis in postmortem human tissue from donors with prolonged postmortem interval (PMI) and probably decreased RNA integrity. Therefore several parameters influencing the reliability of quantitative gene expression data were examined. First, it was found that in postmortem skeletal muscle deceased with an increased body mass index (BMI) reveal decreased RIN values compared to normal weight donors. Moreover, a correlation was found between the type of tissue and the integrity of RNA that was isolated from it. When extracting RNA as presented in this work, postmortem skeletal muscle tissue showed the overall highest RIN values and seems to be best suited for gene expression studies using autopsy material. Using the presented sample set no correlation was found between RNA integrity and parameters like gender, PMI, age at death, duration of agony and cause of death. Second, using postmortem cardiac muscle, skeletal muscle and brain tissue the stability of ten endogenous control genes with different functionality was assessed and HMBS, UBC, SDHA and TBP were identified as genes of high transcript stability. Furthermore, it was shown that four stable endogenous control genes seem to be adequate for a reliable data normalisation. Thus, the four validated control genes mentioned may be used in future quantitative gene expression studies if sample composition is similar to the one presented in this work. Donors cause of death and body mass index were found to significantly influence the expression level of instable genes. Thus, these parameters may be adducted to explain the instability found in some of the assessed potential reference genes. Third, identifying the limit of detection due to degradation processes was found to be an important quality control test for every qPCR assay used. The results of this work confirm the importance of analyzing degradation lines of commercially available RNAs. This information allows the correct interpretation of gene expression levels and an identification of apparent changes in transcript abundances which are the result of degradation rather than biological processes. Finally, it was found that even though it is not always possible to collect only samples with high RIN values, it seems to be workable to use RNA samples of similar integrities in future gene expression studies. Fourth, pathological processes in the human body affecting the function of organs as well as their morphology show high complexity and may vary between individuals. Therefore, analysis of the gene expression status at the time point of death might give valuable hints about donors´ forensically relevant diagnose. Examining the impact of hypoxia on expression levels of HIF-1α, VEGF and SLC2A1 was conducted as a first example. Normalising data against four stable reference genes gave hints to an increased gene expression in donors who died of a hypoxia associated cause of death compared to the control group. Moreover, this study confirmed the particular importance of the elected normalisation strategy. Surprisingly, the four genes of interest suggested a decrease in gene expression after its normalisation against GAPDH as a single nonvalidated control gene. A possible reason for this discrepancy may be found in the apparent instability and the co-regulation of GAPDH under hypoxic conditions. To summarize, the presentation of validated control genes as well as the analysis of parameters affecting RNA integrity and quantitative gene expression data provide a basis for the reliable performance of future gene expression studies using human autopsy samples. This raises hope for the successful implementation of postmortem gene expression studies as additional tool in forensic pathology to assist the determination of somebody´s cause of death.…