Markus Peer

• Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targetedSphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Blätter von A. thaliana führte zu schnell und transient erhöhten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen Rückkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abhängigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten Stämmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdrücken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen könnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter Stämme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, präzise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgelösten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Blätter der A. thaliana Mutante sbh1-1 führte zu transient erhöhten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gestört. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht dafür, dass der pathogenabhängige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 für den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 lösen auch strukturell ähnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, während andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen auslösten. Dies weist auch direkt auf die Spezifität der beteiligten Mechanismen hin.…
• Sphingolipids (SPL) are important and ubiquitously distributed constituents of biological membranes. Due to the tremendous variety, complex structure and diverse physicochemical properties of sphingolipids, qualitative and quantitative analysis has only recently been possible due to newly developed methods in mass spectrometry and chromatography. In this work, analytical methods to quantitatively detect the SPL content in A. thaliana leaves were established based on published literature. Using a targeted metabolic profiling approach, the roleSphingolipids (SPL) are important and ubiquitously distributed constituents of biological membranes. Due to the tremendous variety, complex structure and diverse physicochemical properties of sphingolipids, qualitative and quantitative analysis has only recently been possible due to newly developed methods in mass spectrometry and chromatography. In this work, analytical methods to quantitatively detect the SPL content in A. thaliana leaves were established based on published literature. Using a targeted metabolic profiling approach, the role of specific SPL in the plant‐pathogen interaction was characterized. In line with the production of reactive oxygen species (ROS), a hallmark of biotic stress, infiltration of the avirulent form of the phytopathogen P. syringae pv. tomato (Pst) led to a fast and transient increase of the free long chain base Phytosphingosine (t18:0). Virulent Pst showed also a fast and transient, but clearly less prolonged elevation of t18:0 levels. Also, no HR was elicited in response to the infiltration, pointing to a positive regulatory role of t18:0 in this plant defense response. This work shows, for the first time, that SPL, namely t18:0, were regulated in response to bacterial pathogens. The t18:0 kinetics showed a strong correlation with the course of the pathogen‐elicited HR. There was also evidence, that virulent Pst influences the plants own biosynthetic and regulatory mechanisms to inhibit the SPL mediated defense response. This was also the case with another tested Pseudomonas syringae strain. In this work, free long chain bases showed characteristics typical for signaling molecules: low basal levels, a fast and transient increase in response to pathogens and a tight regulation. Hence, SPL may represent members of signaling pathways in plant‐pathogen interactions in addition to or besides PAMP‐triggered and hormonal mediated signaling pathways. Infiltration of Pst into leaves of the A. thaliana hydroxylase mutant sbh1-1 led to transiently increased d18:0 levels in leaves. In this mutant, one of the two functional sphingobase hydroxylases of A. thaliana is impaired. As the total pool of t18:0 was not significantly reduced in the mutant after total hydrolysis, we argue that the pathogen‐dependent transient increase of t18:0 was due to de novo synthesis from d18:0 and not to the action of specific lipases. Furthermore SBH1 was responsible for the fast increase of t18:0 levels. In addition to t18:0, also other free long chain bases, e.g. d18:0, elicited plant reactions and cell death, whereas other long chain bases (d20:0 and d20:1) or ceramides elicited no response. Apparently, the specific lipid structure plays a major role for the efficiency in different signaling pathways.…