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Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) für eine Antikörpertherapie

Molecular and immunological characterization of immunodominant antigens of MRSA

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108
  • Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. EsZusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen.show moreshow less
  • Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative,Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative, immuno-therapeutical methods can be developed, for example the use of monoclonal antibodies against target elements of S. aureus. A prerequisite for the development of therapeutical antibodies is the identification of immuno-dominant antigens which should preferentially be located on the cell surface of the pathogen or being secreted proteins. Recently, two immunodominant antigens named IsaA and IsaB have been identified which seem to be suitable structures for an antibody-based immuno-therapeutical approach. To learn more about the function of the immunodominant antigens and to evaluate the role in diseases caused by S. aureus in this work an isaB-mutant was constructed and phenotypically characterized. Moreover, a human monoclonal antibody against IsaA should be generated. For testing the specificity of monoclonal antibodies, it was necessary to develop an anti-IsaA-specific ELISA. By fusion of the human heteromyeloma cell line HAB-1 with B-lymphocytes from lymphatic material of patients with sepsis anti-IsaA producing hybridoma clones should be generated and later on tested in different models. By application of the human heteromyeloma cell line cross-reactions of species, as they were observed with murine antibodies, can be circumvented. In this work, several fusions of different lymphatic material were accomplished. However, specific anti-IsaA producing antibodies could not be generated. Furthermore, an anti-IsaA-specific ELISA could successfully be established on the basis of polyclonal anti-IsaA-antibodies from immunized rabbits. The ELISA showed the highest specificity at an antigen-coating of 2 µg/ml of IsaA and an optimal primary antibody concentration of 1:25600. To evaluate the expression of IsaA protein within the species S. aureus and to test the specificity of the antibody Western blot experiments were performed using different S. aureus strains, strains from other staphylococcal species and also non-staphylococcal isolates. These experiments reveal that IsaA is specifically expressed by all S. aureus strains tested, independently of the origin of the strains and regardless the type of infection the strains have caused or the type of resistance they do express. The isaB-mutant was created via constructing an inactivating plasmid (pTG1), in which the erythromycin resistance cassette ermB was cloned between an upstream and downstream fragment of isaB in the temperature-sensitive shuttle-vector pBT2, which cannot replicate in S. aureus at higher temperatures (42°C) facilitating homologous recombination with homologous sequences in the genome. The successful construction of the isaB-mutant was proven by Southern blot hybridization. Moreover, the mutant was submitted to different comparative experiments with the wildtype, in order to get information about the possible function of the target protein IsaB. Growth experiments have clearly demonstrated a faster growth behaviour of the isaB-mutant cells compared to the wildtype. However, in the presence of high salt and glucose concentrations the wildtype grew much faster suggesting a role of IsaB in growth under extreme environmental conditions. The results of this work clearly support the idea of using IsaB as a target protein for immuno-therapy against life-threatening infections due to S. aureus.show moreshow less

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Metadaten
Author: Tanja Geis
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Medizinische Fakultät / Institut für Molekulare Infektionsbiologie
Date of final exam:2006/05/17
Language:German
Year of Completion:2005
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Tag:ELISA; Immuntherapie; MRSA; immunodominante Antigene; monoklonale Antikörper
ELISA; MRSA; immunodominant antigens; immuntherapy; monoclonal antibodies
Release Date:2006/06/16
Advisor:Prof. Dr. Dr. h. c. mult. Jörg Hacker