Christina Nicole Stober

• Das Spurenelement Selen hat in den vergangenen Jahren zunehmend an klinischer Relevanz gewonnen, da einige Krankheiten mit einem Selenmangel in Verbindung gebracht werden konnten. Um den Selenstatus eines Individuums erfassen zu können und gegebenenfalls eine Selen-Substitution einzuleiten, bedarf es einer Methode, die genau, einfach und im klinischen Alltag einsetzbar ist. Die bislang üblichen Verfahren der AAS sind relativ teuer bei der Geräteanschaffung und im Vergleich zu der hier vorgestellten optimierten spektrofluorimetrischen MethodeDas Spurenelement Selen hat in den vergangenen Jahren zunehmend an klinischer Relevanz gewonnen, da einige Krankheiten mit einem Selenmangel in Verbindung gebracht werden konnten. Um den Selenstatus eines Individuums erfassen zu können und gegebenenfalls eine Selen-Substitution einzuleiten, bedarf es einer Methode, die genau, einfach und im klinischen Alltag einsetzbar ist. Die bislang üblichen Verfahren der AAS sind relativ teuer bei der Geräteanschaffung und im Vergleich zu der hier vorgestellten optimierten spektrofluorimetrischen Methode ungenauer. Das derzeit genaueste Verfahren zur quantitativen Selenbestimmung, die NAA, ist aufgrund des immensen zeitlichen Aufwands und hoher Kosten für die klinische Routine ungeeignet. In dieser Arbeit wurde die erstmals von Koh und Benson [56] beschriebene spektrofluorimetrische Methode zur Selenbestimmung so modifiziert und optimiert, dass eine für die klinische Selenbestimmung biologischer Proben geeignete, genaue Methode resultierte. Das zur Bestimmung eingesetzte Volumen an Serum konnte gegenüber dem von Koh und Benson [56] beschriebenen Verfahren um mehr als die Hälfte reduziert werden. Außerdem wurden in dieser Arbeit nur 400 µL einer Selen-Standardprobe im Gegensatz zu dem von Koh und Benson [56] eingesetzten 1 mL verwendet. Durch das geringere Probenvolumen war 1 mL der Säuremischung zum Aufschluss der Proben ausreichend. Die Schritte der Inkubation wurden verkürzt und mittels eines Heizblocks dahingehend vereinfacht, dass Inkubationen im Wasserbad überflüssig waren. Unnötige Wartezeiten durch Vorheizen des Heizblocks wurden ausgelassen. Außerdem wurde die Temperatur auf 190 °C reduziert, weil sie für den Probenaufschluss ausreichend war. Da bei dieser Temperatur die Teflon-beschichteten Deckel der Probenröhrchen geschont wurden, konnten sie für mehrere Versuchsreihen eingesetzt werden. Dies führte zu einer weiteren Kosteneinsparung. Bei der Zugabe von rauchender Salzsäure zu den Proben wurden potenzielle Selenverluste durch Ausspülen der Deckel vermieden. Die Reduktion erfolgte mit offenen Probenröhrchen, was zusätzlich das Abrauchen von überschüssiger Salpetersäure bewirkte. Die Waschvorgänge der DAN-Lösung konnten auf 3 Durchgänge reduziert werden, da sich die Ergebnisse gut mit den Resultaten decken, die man mit den von Koh und Benson [56] verwendeten 4 Waschvorgängen erhielt. Die in der Literatur widersprüchlich diskutierte Frage eines pH-Wert-Einflusses auf die Piazselenolbildung wurde auch für die hier beschriebene Methode erörtert. In Übereinstimmung mit Koh und Benson [56] wurde auch bei der optimierten Methode keine Einstellung des pH-Wertes vorgenommen. Im Gegensatz zu der von Koh und Benson [56] beschriebenen Methode erfolgte in dem hier beschriebenen Verfahren die Zugabe von Cyclohexan zur Extraktion erst nach der Piazselenolbildung, da dadurch die Werte der Standardabweichung erheblich gesenkt werden konnten. Die weitere Optimierung des Extraktionsprozesses beinhaltete den zusätzlichen Gebrauch eines Vibrofix. Entgegen der von Koh und Benson [56] postulierten Unabhängigkeit des Piazselenols gegenüber Lichteinwirkung, ergaben die Untersuchungen zur Lichtempfindlichkeit in dieser Arbeit, dass das Piazselenol direkter Lichteinwirkung nicht ausgesetzt werden sollte. Aus diesem Grund empfiehlt es sich auch, die spektrofluorimetrische Messung derselben Probe nur ein Mal durchzuführen. Die Einstellungen des Perkin-Elmer Modells zur spektrofluorimetrischen Messung erwiesen sich als optimal bei einer Spaltbreite für die Excitation von 2,5 nm, einer Spaltbreite für die Emission von 10 nm, 364 nm für die Excitation, 520 nm für die Emission und einer Integrationszeit von 1 Sekunde. Die Versuche zur Validierung zeigten, dass die hier beschriebene Methode eine zuverlässige und gut reproduzierbare Bestimmung der Selenkonzentration ermöglicht, deren Ergebnisse gut mit denen von standardisierten Referenzsubstanzen übereinstimmen. Ein Selenverlust tritt nicht auf; zu den Proben zugesetztes Selen wird vollständig nachgewiesen. Auch in organischen Verbindungen gebundenes Selen kann gänzlich aus den Verbindungen gelöst und nachgewiesen werden.…
• Background: In this study we describe an optimized spectrofluorimetric method for selenium detection in plasma, serum, urine, or tissue. The method bases on a publication by Koh and Benson in 1982 [1]. Methods: Only 400 µL of a sample are necessary to detect the amount of selenium in a specimen with great precision. Samples are digested with HNO3 / HClO4, then Se (VI) is reduced to Se (IV) with 11,6 M HCl. After adding EDTA as a masking agent, a DAN solution is added, thereby initializing the crucial step of the method: 2,3-DAN and Se (IV)Background: In this study we describe an optimized spectrofluorimetric method for selenium detection in plasma, serum, urine, or tissue. The method bases on a publication by Koh and Benson in 1982 [1]. Methods: Only 400 µL of a sample are necessary to detect the amount of selenium in a specimen with great precision. Samples are digested with HNO3 / HClO4, then Se (VI) is reduced to Se (IV) with 11,6 M HCl. After adding EDTA as a masking agent, a DAN solution is added, thereby initializing the crucial step of the method: 2,3-DAN and Se (IV) react to form a piazselenol. Then, the piazselenol is extracted with cyclohexane and can finally be detected quantitatively by spectrofluorimetry. Results: Precision of this method (intra-& inter-assay variation)…Recovery of radioactively marked 75Se was 86,4%, selenium from organic compounds was recovered to 100%, and 98,8% of selenium contained in standardized serum were detected with our method. The lower limit of detection for the presented method lies at 3 µg/L. Conclusions: Compared to other methods employed for selenium detection, such as AAS and NAA, the method described in this study presents itsself as a very sensitive, inexpensive, and time-efficient alternative.…