Benjamin Röser [geb. Aßmus]

• Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs, welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2- defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie, sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2- Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären StrukturenDas Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs, welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2- defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie, sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2- Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle, sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen der Mitochondrien gekennzeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende (E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2- KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5- Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht. Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt. Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der Vesikel in Einklang bringt. Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2- defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt.…
• The Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures within the cell, as well as a decisiveThe Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures within the cell, as well as a decisive number of vesicles along the longitudinal rows of mitochondria. The aim of this work was to elucidate the properties of these vesicular structures and to determine in which context the subcellularly modified architecture and the hypertrophy of the SPRED2 deficient animals stand to each other. To answer this question, a protein degradation mechanism that could be changed within the SPRED2 deficient cardiomyocytes was identified. Macroautophagy, further called autophagy, is such a degradation mechanism, which degrades long-lived proteins and cell organelles. This work identified significant changes made to the protein level of key regulators of autophagy. The ubiquitin-activating (E1) enzyme homolog Atg7 as well as the cystein protease Atg4B are reduced in the SPRED2 KO. Similarly, Atg16L, which acts as an essential part of the Atg5-Atg12-Atg16 conjugation system in the process of conjugating MAPLC3 to the phospholipid phosphatidylethanolamine. The autophagic flux, as the relation between conjugated and unconjugated MAPLC3, is reduced in the knockout as well. The accumulation of autophagic vesicles is in accordance with the elevated protein levels of the cargo receptors SQSTM1 and NBR1 as well as the lysosomal marker CathepsinD. Besides the reduced autophagic flux there is an elevated protein level of activated caspase-3 as a marker of apoptosis. To further elucidate the mitochondrial integrity, the endogenous levels of reactive oxygen species were determined in wildtype and knockout individuals. It was shown that the SPRED2 knockout contains an elevated level of ROS which could be a sign of reduced mitochondrial survival. Finally, it was investigated whether the disturbed transport of vesicles was due to impaired motor protein efficiency. It was shown that the activity of the dynein ATPase was reduced when SPRED2 was absent. This observation is supported by the elevated levels of the vSNARE protein VTI1b, which connects the accumulation of autophagic vesicles with the reduced ability to membrane fusion and a less efficient transport of vesicles. The experiments of this work were conducted in a global SPRED2-KO system. Possible effects of the changed hormonal situation of the SPRED2 deficient animals to the heart phenotype cannot be excluded. For that reason a conditional SPRED2 knockout mouse line with conditional potential was created capable of further elucidating the effect of a SPRED2 deficiency to the heart.…