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Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging

Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905
  • This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss theirThis thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging.show moreshow less
  • In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-LokalisationsmikroskopieIn dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt.show moreshow less

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Metadaten
Author: Sven Martin Proppert
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Physik und Astronomie
Faculties:Fakultät für Physik und Astronomie / Physikalisches Institut
Fakultät für Biologie / Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Referee:Prof. Dr. Markus Sauer
Date of final exam:2014/12/19
Language:English
Year of Completion:2014
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 53 Physik / 539 Moderne Physik
GND Keyword:Dimension 3; Einzelmolekülmikroskopie; Mikroskopie; Hochauflösendes Verfahren
Tag:Aberration
3D; aberration; single molecule microscopy; super-resolution
PACS-Classification:80.00.00 INTERDISCIPLINARY PHYSICS AND RELATED AREAS OF SCIENCE AND TECHNOLOGY / 87.00.00 Biological and medical physics / 87.64.-t Spectroscopic and microscopic techniques in biophysics and medical physics / 87.64.M- Optical microscopy / 87.64.mc Bright field
Release Date:2015/12/21
Licence (German):License LogoCC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen