Julia Schoof

• Follikuläre Lymphome (FL) machen etwa 25-40% der Non-Hodgkin-Lymphome aus und sind in der Regel bereits bei Diagnosestellung nicht mehr auf den Lymphknoten beschränkt, sondern systemische Erkrankungen. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die selten diagnostizierten limitierten Stadien (Ann Arbor I und II) der Erkrankung häufig einen nur partiellen Befall der betroffenen Lymphknoten durch das Lymphom zeigen. In diesen frühen Stadien kolonisieren follikuläre Lymphome präexistente Follikel (in situ- Lymphom) und breiten sichFollikuläre Lymphome (FL) machen etwa 25-40% der Non-Hodgkin-Lymphome aus und sind in der Regel bereits bei Diagnosestellung nicht mehr auf den Lymphknoten beschränkt, sondern systemische Erkrankungen. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die selten diagnostizierten limitierten Stadien (Ann Arbor I und II) der Erkrankung häufig einen nur partiellen Befall der betroffenen Lymphknoten durch das Lymphom zeigen. In diesen frühen Stadien kolonisieren follikuläre Lymphome präexistente Follikel (in situ- Lymphom) und breiten sich dann offenbar auf die übrigen Follikel des Lymphknotens aus, bevor ein systemischer Befall des gesamten Organismus feststellbar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst zu untersuchen, auf welchem Weg die Zellen eines Tumorklons im follikulären Lymphom die Keimzentren eines Lymphknotens kolonisieren. Dazu wurde die genetische Verwandtschaft der einzelnen Tumorsubklone untereinander anhand ihrer individuellen Mutationsmuster bestimmt. Mit Hilfe von daraus berechneten phylogenetischen Stammbäumen konnte die Ausbreitung der Subklone auf die vorbestehenden Keimzentren nachvollzogen werden. Zweitens sollte in dieser Studie der Frage nachgegangen werden, ob die Tumorsubklone auch unter dem Einfluss der Keimzentrumsumgebung stehen, die in der physiologischen B-Zell-Reifung für die enorme Vielfalt der Antikörperspezifität sorgt (Hypermutation). Anhaltende Mutationen (ongoing mutations) innerhalb eines Tumorklons würden auf einen solchen erhaltenen Einfluss der Hypermutationsmaschinerie hinweisen. Schließlich sollte untersucht werden, ob es auch in follikulären Lymphomen eine antigenabhängige B-Zell-Reifung gibt, wie sie bei der physiologischen „Optimierung“ von Antikörpern auf die korrespondierenden Antigene zu finden ist. Material und Methode: Sieben Fälle von follikulären Lymphomen von vier Patienten (davon einer mit einem und einer mit zwei Rezidiven ihrer Lymphomerkrankung) wurden morphologisch und immunhistochemisch reevaluiert. Pro Fall wurden bis zu zehn Follikel mikrodisseziert und pro Follikel die VH-Gene von bis zu zehn Subklonen sequenziert. Computerunterstützt wurden sowohl die genetische Verwandtschaft der Tumorsubklone untereinander und ihre Verteilung auf die einzelnen Follikel, als auch das Verhältnis von R- zu S- Mutationen in den verschiedenen Abschnitten des BCR-Gens und damit ein möglicher Antigen-Einfluss auf die Hypermutation analysiert. Ergebnisse: Ein FL Grad I zeigte ein deutliches Clustering von genetisch miteinander verwandten Tumorsubklonen im selben Follikel. Dennoch fand sich ein moderater interfollikulärer Austausch der Subklone. Bei morphologisch höhergradigen FL (Grad II und IIIa) nahm das Clustering deutlich ab und der interfollikuläre Austausch zu, bis im zweiten Rezidiv eines Patienten ein weitgehend diffuses Wachstum resultierte. Als Ausdruck des erhaltenen Einflusses des Keimzentrums zeigten alle Primärtumoren (FL Grad I und II) noch ongoing mutations, während bei FL in Progression keine ongoing mutations mehr feststellbar waren. Eine Häufung von R-Mutationen in den antigenbindenden Domänen des B-Zell-Rezeptors (CDR) und S-Mutationen in den strukturellen Domänen (FR) als Hinweis auf eine antigen-gesteuerte Hypermutation in den Tumorsubklonen fand sich nur in einem FL Grad I. Aus den genetischen Analysen ergaben sich aber Hinweise auf eine erhaltene Funktionalität des B-Zell-Rezeptors in allen sieben Fällen.…
• Follicular lymphoma (FL) is in general diagnosed in clinical advanced stages (Ann Arbor III/IV), thus being a systemic disease. Recent studies showed that especially in cases with limited disease (early clinical stages) FL cells home to and colonize reactive germinal centers (so-called "in situ localization" of FL). Laser microdissection (LMD) and micromanipulation allow moleculargenetic analysis of single cell mutation patterns. Purpose of the study was to analyze the influence of the germinal centre microenvironment on the clonal evolution inFollicular lymphoma (FL) is in general diagnosed in clinical advanced stages (Ann Arbor III/IV), thus being a systemic disease. Recent studies showed that especially in cases with limited disease (early clinical stages) FL cells home to and colonize reactive germinal centers (so-called "in situ localization" of FL). Laser microdissection (LMD) and micromanipulation allow moleculargenetic analysis of single cell mutation patterns. Purpose of the study was to analyze the influence of the germinal centre microenvironment on the clonal evolution in different grades of FL and in tumor progression without transformation to a high-grade lymphoma. By generating phylgenetic trees from the tumor cell sequences, the clonal evolution from a putative progenitor cell was elucidated and finally, the tumor cell distribution in disease progression was detected by analyzing biopsies at different time points of FL relapses. Four patients with FL were included in the study. A FL grade 1 showed clustering of genetically related subclones in distinct follicles. A moderate interfollicular exchange of tumor cells was detected. Three cases of FL grade 2 were found to show decreased subclonal clustering in follicles and an augmentation of the interfollicular exchange rate. Accumulation of replacement mutations in antigen binding domains (CDR) resp. silent mutations in non-antigen binding domains (FR), indicating antigen influence on hypermutation were only found in FL grade 1. Conclusion: Microenvironment of germinal center exerts influence on clonal evolution and subclonal distribution pattern in FL. With increasing histologic grade during disease progression a reduction of intraclonal diversity and a selection of subclones occurs also without transformation to a high-grade lymphoma. Antigen-influenced hypermutation was only seen in a FL grade 1, while in progressed FL random mutation patterns and decrease of clonal diversity was found.…