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Resistenztestung von Pilzen : Untersuchungen zur Epidemiologie, zum Vergleich des Verfahrens nach DIN und NCCLS, sowie zur Evaluierung des YeastOne-Systems

Antifungal susceptibility testing: analysis of epidemiology, comparison of the protocols by DIN and NCCLS and evaluation of the YeastOne assay

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-16733
  • Invasive Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen und bedrohen insbesondere immunsupprimierte Patienten. Nach der Zulassung von neuen antimykotisch wirksamen Substanzen hat sich das verfügbare Spektrum an therapeutischen Optionen deutlich erweitert. Demgegenüber steckt die verfügbare Technik zur Resistenztestung humanpathogener Pilze noch weitgehend in den Kinderschuhen. Die Analyse zur Verfügung stehender Techniken ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck werden zunächst die Daten von 728 klinischen IsolatenInvasive Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen und bedrohen insbesondere immunsupprimierte Patienten. Nach der Zulassung von neuen antimykotisch wirksamen Substanzen hat sich das verfügbare Spektrum an therapeutischen Optionen deutlich erweitert. Demgegenüber steckt die verfügbare Technik zur Resistenztestung humanpathogener Pilze noch weitgehend in den Kinderschuhen. Die Analyse zur Verfügung stehender Techniken ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck werden zunächst die Daten von 728 klinischen Isolaten von Candida spp., die zwischen April 2000 und November 2002 am Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg unter Anwendung des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN getestet wurden, unter epidemiologischen Aspekten ausgewertet. Es zeigt sich ein deutliches Überwiegen von Candida albicans (53%), gefolgt von Candida glabrata (26%). Candida parapsilosis und Candida tropicalis hatten jeweils einen Anteil von ca. 7%. Sowohl Candida albicans wie auch Candida glabrata verhielten sich gegen Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin in hohem Maße sensibel. Candida krusei und Candida tropicalis wurden zu einem nennenswerten Anteil resistent, vor allem gegen Fluconazol und 5-Flucytosin, getestet. Im zweiten Teil der Arbeit wird anhand von 56 Candida spp. ein Vergleich des Mikrodilutionsverfahrens nach DIN und des internationalen Standardverfahrens nach NCCLS durchgeführt. Es zeigen sich sowohl hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Ablesezeitpunkt der minimalen Hemmkonzentration sowie Stabilität der Testergebnisse über den angestrebten Ablesezeitpunkt hinaus deutliche Vorteile des NCCLS- gegenüber dem DIN-Verfahren. Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Protokollen liegt im verwendeten Wachstumsmedium. Ein Problem beider Verfahren besteht im großen Zeitaufwand, weshalb das YeastOne-Testverfahren, ein kommerziell erhältliches Mikrodilutionsverfahren, das den Farbindikator Alamar Blue zur Erleichterung der visuellen Endpunktbestimmung beinhaltet, im dritten Teil der Arbeit für die Anwendung am Institut in Würzburg gegenüber der NCCLS-Methode evaluiert wird. Es zeigt sich eine hohe Reproduzierbarkeit mit ca. 96% bei Fluconazol, Amphotericin B und 5-Flucytosin und eine gute Korrelation zum Standardverfahren nach NCCLS. Entscheidende Vorteile gegenüber dem NCCLS-Protokoll sind eine frühere Endpunktbestimmung für Azole, die bereits nach 24 Stunden erfolgen kann, sowie in der Zeitersparnis zwischen 64% und 94%. Ergänzend werden einige Schimmelpilze sowohl mit dem NCCLS- als auch mit dem YeastOne-Verfahren getestet, wobei sich eine hohe Korrelation der YeastOne- mit den NCCLS-Ergebnissen zeigt und sich für beide Vorgehensweisen der Ablesezeitpunkt bei gutem Wachstum nach 48 Stunden festlegen lässt. Die Resistenztestung klinischer Isolate wurde daraufhin im Institut für Hygiene und Mikrobiologie auf das YeastOne-System umgestellt. In ersten Anwendungen wurden dabei gute Ergebnisse erzielt.show moreshow less
  • The prevalence of invasive fungal infections, threatening mainly immunocompromised patients, has increased steadily during the last years. After recent the licensing of new antifungal drugs, the spectrum of therapeutic options has widened considerably. However, the available techniques for in vitro antifungal susceptibility testing are still being developed. The analysis of available techniques is the focus of this thesis. For that purpose, a retrospective epidemiological analysis of the data from 728 clinical Candida spp. isolates from theThe prevalence of invasive fungal infections, threatening mainly immunocompromised patients, has increased steadily during the last years. After recent the licensing of new antifungal drugs, the spectrum of therapeutic options has widened considerably. However, the available techniques for in vitro antifungal susceptibility testing are still being developed. The analysis of available techniques is the focus of this thesis. For that purpose, a retrospective epidemiological analysis of the data from 728 clinical Candida spp. isolates from the years 4/2000 – 11/2002, isolated and tested for susceptibility against antifungal drugs using a microdilution assay (DIN) at the Institute of Hygiene and Microbiology, is performed. Candida albicans is the most frequently isolated species (53%) followed by Candida glabrata (26%). Candida parapsilosis and Candida tropicalis each were found in 7% of the cases. Candida albicans and Candida glabrata were highly susceptible against fluconazole, amphotericin B and 5-flourocytosine. In contrast, a significant percentage of Candida krusei and Candida tropicalis were found to be resistant mainly against fluconazole and 5-fluorocytosine. In the second part of the thesis, a comparison of the microdilution assay protocols by NCCLS and DIN is performed using 56 clinical isolates of Candida spp. The NCCLS assay is found to be superior with regard to reproducibility, time of enpoint determination and stability of results after optimum enpoint incubation time. The main difference between both assays is the composition of the growth medium. A handicap of both assays is the time consuming procedure of assay preparation and handling. Therefore the commercially available YeastOne microdilution assay, integrating Alamar Blue indicator for visual endpoint determination, is compared with the NCCLS assay. For this assay, a good reproducibility (96%) and correlation to the NCCLS results can be demonstrated for fluconazole, amphotericin B and 5-flourocytosine. Major advantages are the shorter endpoint determination for azoles, which can be performed after 24h, and a total reduction of handling time of 64 – 94. In addition to yeasts, a collection of moulds is tested parallel with the NCCLS assay and the YeastOne assay. The results show a good correlation of both methodologies after an incubation time of 48h until endpoint reading. Based on the present results, routine antifungal susceptibility testing of clinical isolates at the Institute of Hygiene and Microbiology will in future be performed with the YeastOne system. The first experiences with this technique in routine testing have been satisfying.show moreshow less

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Metadaten
Author: Peggy Hummel-Kemmer
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-16733
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Medizinische Fakultät / Institut für Hygiene und Mikrobiologie
Date of final exam:2006/02/03
Language:German
Year of Completion:2006
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Tag:Epidemiologie; NCCLS; Pilzinfektionen; Resistenztestung; YeastOne
NCCLS; YeastOne; antifungal susceptibility testing; epidemiology; infections
Release Date:2006/02/07
Advisor:Prof., Dr. Matthias Frosch