Fabian Schwiering

• Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer übermäßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen führen kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiemöglichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung beiMittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer übermäßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen führen kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiemöglichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es ermöglichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden können, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden können. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert – den Zellen, die wahrscheinlich für den übermäßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer stärkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erhöhten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reportermäusen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato−; (2) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato−. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Auflösung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber hauptsächlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Auflösung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Auflösung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Auflösung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollständig ersetzt. Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer veränderten Leberfibrose führt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. Während bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erhöhte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die NO-GC über die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose ausübt.…
• By means of the questions addressed in this work, new insights were gained on the role of NO-GC in the pathogenesis of lung and liver fibrosis. As a result of fibrosis in the lungs and liver, there is an excessive accumulation of EZM, which can lead to organ failure. So far, there are only a few treatment options available for the treatment of organ fibrosis. However, it has recently been shown that the use of NO-GC-stimulators/activators can improve/heal diverse organ fibrosis. Therefore, NO-GC is thought to play a modulatory role in theBy means of the questions addressed in this work, new insights were gained on the role of NO-GC in the pathogenesis of lung and liver fibrosis. As a result of fibrosis in the lungs and liver, there is an excessive accumulation of EZM, which can lead to organ failure. So far, there are only a few treatment options available for the treatment of organ fibrosis. However, it has recently been shown that the use of NO-GC-stimulators/activators can improve/heal diverse organ fibrosis. Therefore, NO-GC is thought to play a modulatory role in the development of organ fibrosis, however, effector cells are still not known. In the first part of this work, the effector cells of the lung were examined in vitro. Since it is known that NO-GC in the lung is expressed in pericytes, a protocol was established that allowed to specifically isolate pericytes from the lung and bring them into culture. By using different markers, these isolated pericytes were further characterized. Furthermore, NO-GC-expression was detected in these isolated cells. In addition, pericytes can also be marked by a marker (SM/MHC), which is actually known as a VSMC-marker. These data were analogous to the in vivo data of Aue et al.. Although, it was investigated whether these NO-GC-expressing pericytes differentiated into myofibroblasts in culture. This was not been achieved by stimulation with TGF-β1. In the second part of this work, it was investigated in which cells in of the liver NO-GC is expressed. In vivo it could be shown that NO-GC is expressed in HSC of the liver. Since it is known that the NO-GC has an influence on organ fibrosis, NO-GC-expression in liver fibrosis was investigated. It was found that there is an increased NO-GC-expression in CCl4-induced liver fibrosis. Expression was mainly found in myofibroblasts - the cells likely responsible for production of EZM. To further investigate the influence of NO-GC on liver fibrosis, fibrosis between WT and GCKO animals was compared. It could be observed that there was a stronger fibrosis in GCKO-animals than in WT-animals, as seen by an increased accumulation of collagen and an increased expression of TGF-β1. This demonstrated that NO-GC plays a likely protective role in liver fibrosis. In the third part of this work, the role of HSC in liver fibrosis was examined in more detail. For the first time, it was found that HSC can be subdivided into subpopulations. Reporter mice expressing the tdTomato fluorophore under the SM/MHC- or PDGFRβ-promoter allowed the subdivision of the HSC into 3 subpopulations: (1) SM/MHC-Tomato − and PDGFRβ-Tomato −; (2) SM/MHC- Tomato − and PDGFRβ-Tomato+ and (3) SM/MHC-Tomato + and PDGFRβ-Tomato −. HSC lineage tracing-experiments showed that these subpopulations have different roles during liver fibrosis and the resolution. In the healthy liver subpopulation, 1 is mainly located in zones 2 and 3 of the liver acinus. In fibrosis, these cells migrate to the fibrotic regions and differentiate into myofibroblasts. In the dissolution phase of fibrosis, these cells disappear by apoptosis. Under physiological conditions, HSC-subpopulation 2 are located to zone 1 of the liver acinus. Even in and after the dissolution of liver fibrosis these cells persist. HSC-subpopulation 3 in the healthy liver is also only in zone 1 of the liver acinus. In fibrosis these cells migrate to zone 2 and 3 were they replace HSC-subpopulation 1 that has migrated into the fibrotic region. After dissolving of liver fibrosis, subgroup 3 has completely replaced population 1. After identifying the HSC-subpopulation, the question was whether a specific section of the NO-GC leads to altered liver fibrosis compared to WT. For this purpose, NO-GC was deleted under SM/MHC- and PDGFRβ-promoter and fibrosis was investigated in these knockouts. While there was no difference in the deletion of NO-GC under the PDGFRβ-promoter compared to WT, SM/MHC-GCKO showed different results. The excision of NO-GC in the cells of HSC- subpopulation 3 resulted in a decreased expression of PPARγ in the healthy liver. Since PPARγ acts as an antagonist of the TGF-β1-pathway, increased TGF-β1-expression in SM/MHC-GCKO was seen in the healthy and fibrotic liver compared to WT-liver. These results suggest that NO-GC has a protective effect on liver fibrosis by the control of PPARγ.…