Hannes Schihada

• G-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamicsG-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamics in living cells and real time. However, to date, these conformational GPCR studies are restricted to single-cell microscopic setups, slowing down the discovery of novel GPCR-directed therapeutics. In this work, we present the development of a novel generalizable high-throughput compatible assay for the direct measurement of GPCR activation and deactivation. By screening a variety of energy partners for fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), we identified a highly sensitive design for an α2A-adrenergic receptor conformational biosensor. This biosensor reports the receptor’s conformational change upon ligand binding in a 96-well plate reader format with the highest signal amplitude obtained so far. We demonstrate the capacity of this sensor prototype to faithfully quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. Furthermore, we confirm its universal applicability by cloning and validating five further equivalent GPCR biosensors. To prove the suitability of this new GPCR assay for screening purposes, we measured the well-accepted Z-factor as a parameter for the assay quality. All tested biosensors show excellent Z-factors indicating outstanding assay quality. Furthermore, we demonstrate that this assay provides excellent throughput and presents low rates of erroneous hit identification (false positives and false negatives). Following this phase of assay development, we utilized these biosensors to understand the mechanism and consequences of the postulated modulation of parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) through receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2). We found that RAMP2 desensitizes PTHR1, but not the β2-adrenergic receptor (β2AR), for agonist-induced structural changes. This generalizable sensor design offers the first possibility to upscale conformational GPCR studies, which represents the most direct and unbiased approach to monitor receptor activation and deactivation. Therefore, this novel technology provides substantial advantages over currently established methods for GPCR ligand screening. We feel confident that this technology will aid the discovery of novel types of GPCR ligands, help to identify the endogenous ligands of so-called orphan GPCRs and deepen our understanding of the physiological regulation of GPCR function.…
• Die Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifischeDie Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifische GPCR-Konformationen. Diese dienen wiederum als Ausgangspunkt für nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskaden, die beispielweise über membranverankerte G-Proteine vermittelt werden können. Während endogene GPCR-Agonisten diese Signalweiterleitung verstärken, können andere Biomoleküle wie Lipide, Ionen oder andersartige Membranproteine die Funktion, und damit die Signalweiterleitung der GPCRs modulieren. Aufgrund ihrer Einbindung in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, wurden GPCRs schon früh als Angriffspunkte („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt. Heutzutage vermitteln etwa 30% aller zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung über G-protein-gekoppelte Rezeptoren. Dennoch wird das große Potential dieser Rezeptorfamilie als Targets für medikamentöse Behandlungen noch nicht in vollem Umfang ausgeschöpft. Tatsächlich gibt es für mehr als 200 GPCRs, die nicht der olfaktorischen Wahrnehmung dienen, noch keine Arzneistoffe, da wenig über deren Pharmakologie und physiologische Bedeutung bekannt ist. Zudem wird die Entwicklung neuartiger GPCR-Liganden erheblich durch das eingeschränkte Methodenrepertoire beeinträchtigt. Alle derzeit etablierten Techniken zur Identifizierung neuer GPCR-Liganden erfassen entweder den Ligand-GPCR-Bindungsprozess, der keine Informationen über die tatsächliche Aktivität der Verbindung liefert, oder messen weit-nachgeschaltete Signale, wie Änderungen sogenannter „Second-Messenger“-Konzentrationen (meist cAMP oder Calcium) und Reporter-Gen-Expressionslevel. Aufgrund ihrer Entfernung vom eigentlichen Rezeptor-Aktivierungsprozess haben diese Methoden allerdings bedeutende Nachteile und produzieren so häufig Falsch-Positive und Falsch-Negative Ergebnisse. Seit den frühen 2000er wurden GPCR-Konformationssensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zur Messung der Ligand-induzierten Rezeptordynamik genutzt. Jedoch wies keiner der bisher entwickelten FRET- oder BRET- (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Sensoren ausreichende Signalstärke auf, um im Hochdurchsatz-Screening (HTS) angewendet werden zu können. Die vorliegende Studie beschreibt das erste GPCR-Sensordesign, das aufgrund seiner exzellenten Signalstärke im Hochdurchsatz-Verfahren verwendet werden kann. Wir haben 21 unterschiedliche FRET- und BRET-Sensoren des α2A-adrenergen Rezeptors (α2AAR) getestet und dabei die Kombination der kleinen und hellen Luziferase NanoLuciferase (Nluc) mit dem rot-fluoreszierenden HaloTag-Farbstoff 618 als sensitivstes RET-Paar identifiziert. Der α2AARNluc/Halo(618) Biosensor ermöglicht die Messung der Aktivität und Wirkstärke von α2AAR-Liganden im Mikrotiterplattenformat. Um die universelle Anwendbarkeit dieses Sensordesigns zu prüfen, wurden fünf weitere Nluc/Halo(618)-basierende Sensoren für GPCRs unterschiedlicher Unterfamilien entwickelt. Zudem konnten wir zeigen, dass diese GPCRNluc/Halo(618)-Fusionsproteine weiterhin ihre natürlichen Signalkaskaden in Gang setzen können und damit die biologische Funktionalität dieser Rezeptoren erhalten ist. Außerdem belegt die vorlegende Arbeit, dass diese neue Sensor-Generation zur Messung Ligand-vermittelter Rezeptordynamiken im Hochdurchsatz-Format und zur Untersuchung der GPCR-Regulation durch endogene Modulatoren genutzt werden kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir den ersten HTS-kompatiblen Assay zur Messung der GPCR-Konformationsänderungen entwickelt haben. Diese Biosensoren erlauben die Charakterisierung neuartiger GPCR-Liganden direkt auf der Rezeptorebene und funktionieren damit unabhängig von nachgeschalteter Signalamplifikation oder Überlagerung verschiedener Signalwege, welche die Aussagekraft traditioneller GPCR-Screening-Verfahren häufig beeinträchtigen. Diese Technik kann zur Entdeckung neuartiger GPCR-Arzneistoffe genutzt werden, zu einem besseren Verständnis bisher kaum erforschter Rezeptoren beitragen und der Identifizierung und Charakterisierung potentieller GPCR-Modulatoren dienen.…