Boris Nowotny

• Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eineAls einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellulären Screening-Assays für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zelluläre Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme für die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den primären Assay für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays ergänzt. Diese sekundäre Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen ermöglichen die drei Assays die präzise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repräsentiert damit ein weiteres Testsystem für die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme für die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zukünftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika für die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen.…
• One of the first cellular HIV restriction factors isolated was the cytosine deaminase APOBEC3G. This cellular enzyme was shown to efficiently inhibit the replication of HIV and other viruses. Further research revealed that restriction of the viral replication is primarily based on a deaminase-catalyzed G to A hypermutation of the viral genome during reverse transcription. As a mode of counteraction, the HIV-1 encoded accessory protein Vif (virion infectivity factor) binds to A3G leading to its ubiquitin-dependent proteasomal degradation. It hasOne of the first cellular HIV restriction factors isolated was the cytosine deaminase APOBEC3G. This cellular enzyme was shown to efficiently inhibit the replication of HIV and other viruses. Further research revealed that restriction of the viral replication is primarily based on a deaminase-catalyzed G to A hypermutation of the viral genome during reverse transcription. As a mode of counteraction, the HIV-1 encoded accessory protein Vif (virion infectivity factor) binds to A3G leading to its ubiquitin-dependent proteasomal degradation. It has been hypothesized that inhibition of the A3G degradation rescues the antiviral properties of the APOBEC3 protein and thus represents an attractive target for novel antiretroviral drugs. Therefore, the goal of this study was to establish cellular screening assays for the identification of inhibitors of the Vif mediated A3G degradation. Four fluorescent based cellular assays have been established for the screening of small organic compounds. Three of these assays are based on stable cell lines, one of which co-expresses Vif and an EYFP tagged A3G protein. This so-called A3G degradation assay represents the primary assay for identification of degradation inhibitors and is complemented by two additional cell line based assays. These secondary assays enable the detection of compounds generating false-positive or false-negative signals in the A3G degradation assay. These systems allow the precise identification of true-positive A3G degradation inhibitors and thus representing a significant improvement of existing screening platforms. Furthermore, a cellular assay based on the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) was developed. The BiFC-assay measures the direct interaction between Vif and ElonginC in living cells and can be used as a new screening platform for identification of inhibitors targeting the Vif- ElonginC interaction, which is an essential step in the A3G degradation sequence. The aim of the second part of the project was the application of the established screening assays for testing of derivatives of the Vif antagonist RN-18 and rational designed inhibitors targeting the direct interaction between Vif and ElonginC. As a result of the compound testing it was shown, that RN-18 is cytotoxic and generates a false-positive signal in the A3G degradation assay. In case of the Vif-ElonginC interaction inhibitors one compound exhibited a strong inhibitory effect on A3G degradation in an initial screen. Taken together, screening assays for the precise identification of specific inhibitors of the A3G degradation were successfully established. These screening assays will accelerate the identification of novel anti-HIV agents.…