Clara Dorothea Elsner

• Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release inExtracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies.…
• Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegendenExtrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können.…