David Stegner

• This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF)This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF) immobilized on the exposed subendothelial extracellular matrix (ECM). The central importance of GPIb for platelet adhesion is well established, whereas GPV is generally considered to be of minor relevance for platelet physiology and thrombus formation. This study intended to clarify the relevance of this receptor during thrombus formation using Gp5-/- mice and mice with different double-deficiencies in GPV and in other platelet receptors. It was found that GPV and the collagen receptor integrin a2b1 have partially redundant functions in collagentriggered platelet aggregation. Further, it was revealed that GPV limits thrombus formation and impairs hemostasis in vivo. The data presented here demonstrate that the protective effect of GPVI-deficiency (another platelet collagen receptor) in arterial thrombosis and ischemic stroke depends on the expression of GPV. Moreover, it was demonstrated that lack of GPV restores the hemostatic function of mice lacking both GPVI and a2b1 or mice lacking GPVI and the C-type lectin receptor 2 (CLEC-2). Conclusively, GPV-depletion or blockade might have the potential to treat hemorrhagic disease states. ii) Platelets contain the two phospholipase (PL) D isoforms, PLD1 and PLD2, both of which presumably become activated upon platelet stimulation. However, the function of PLD in the process of platelet activation and aggregation has not been definitively explored. Thus, PLD-deficient mice were analyzed. Mice lacking PLD1 or PLD2 were viable, fertile and had normal platelet counts. PLD1 was found to be responsible for the inducible PLD-activity in platelets and to contribute to efficient integrin activation under static conditions. Moreover, flow adhesion experiments revealed that PLD1 is essential for efficient GPIb-mediated integrin activation. Consequently, Pld1-/- mice were protected from arterial thrombosis and ischemic brain infarction without affecting tail bleeding times. Hence, inhibition of PLD1 might be a novel approach for antithrombotic therapy. iii) Cellular activation of platelets or immune cells results in increased cytosolic calcium (Ca2+) levels. Store-operated calcium entry (SOCE) via the STIM1-Orai1 axis is the main route of Ca2+ entry downstream of immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) receptor stimulation in mast cells and T cells. However, the requirement of Ca2+-mobilization in Fcg receptor (FcgR)-signaling and the relevance of STIM2 for T cell SOCE have been unclear. To address these questions, genetically modified mice lacking central molecules of the SOCE machinery were analyzed. Ca2+-measurements revealed that both STIM isoforms contribute to Ca2+-mobilization downstream of T cell receptor activation. Additionally, it was found that FcgR stimulation results in SOCE and is mediated by STIM1 and probably Orai1. Animal models of immune thrombocytopenia (ITP) revealed that SOCE is essential for platelet clearance and that both STIM isoforms contribute to the pathology of ITP. Moreover, in this work it was also demonstrated that STIM1 and Orai1 are essential in IgG-mediated systemic anaphylaxis. STIM2 contributes to IgG-mediated, but not to IgE-mediated anaphylaxis. The data indicate that interference with SOCE might become a new strategy to prevent or treat IgG-dependent autoimmune diseases.…
• Diese Arbeit fasst Untersuchungen von drei wesentlichen Aspekten der Signalwege von Blutplättchen und der Pathogenese der Immunthrombozytopenie zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in drei Teile unterteilt. i) Die Aktivierung von Blutplättchen und die anschließende Thrombusbildung in Folge vaskulärer Verletzungen sind für die normale Hämostase elementar, sie können aber auch Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Die anfängliche Adhäsion zirkulierender Blutplättchen an der verletzten Gefäßwand wird durch die Wechselwirkung desDiese Arbeit fasst Untersuchungen von drei wesentlichen Aspekten der Signalwege von Blutplättchen und der Pathogenese der Immunthrombozytopenie zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in drei Teile unterteilt. i) Die Aktivierung von Blutplättchen und die anschließende Thrombusbildung in Folge vaskulärer Verletzungen sind für die normale Hämostase elementar, sie können aber auch Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Die anfängliche Adhäsion zirkulierender Blutplättchen an der verletzten Gefäßwand wird durch die Wechselwirkung des Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Komplexes mit dem auf der freigelegten subendothelialen Matrix immobilisierten von Willebrand Faktor (vWF) vermittelt. Die zentrale Bedeutung von GPIb für die Adhäsion von Blutplättchen ist lange bekannt, wohingegen GPV allgemein als unbedeutend für die Physiologie von Blutplättchen oder die Thrombusbildung angesehen wird. Das Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung dieses Rezeptors für die Thrombusbildung zu überprüfen. Hierfür wurden GPV-defiziente Mäuse und mehrere Mauslinien, denen neben GPV ein weiterer Plättchenrezeptor fehlte, analysiert. Es wurde festgestellt, dass GPV und der Kollagenrezeptor Integrin a2b1 teilweise redundante Funktionen in der Kollagenvermittelten Plättchenaggregation haben. Des Weiteren wurde gezeigt, dass GPV die Thrombusbildung begrenzt sowie die Wundstillung reguliert. Die hier gezeigten Daten belegen, dass GPV überraschenderweise für den Schutz vor arterieller Thrombose oder ischämischem Schlaganfall, der aus dem Fehlen des wichtigsten Kollagenrezeptors GPVI resultiert, benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass die Abwesenheit von GPV die Hämostase in Mäusen, denen GPVI und a2b1 oder GPVI und CLEC-2 (von C-type lectin receptor 2) fehlt, wieder herstellt. Folglich, könnte die pharmakologische Herabregulierung der GPV-Expression oder die Blockade des Rezeptors eine neue Behandlungsmöglichkeit von hämorrhagischen Krankheitszuständen darstellen. ii) Blutplättchen exprimieren die beiden Phospholipase (PL) D Isoformen PLD1 und PLD2, die vermutlich beide im Zuge der Blutplättchenstimulation aktiviert werden. Allerdings wurde die Rolle von PLD in der Thrombozytenaktivierung und -aggregation noch nicht abschließend untersucht. Daher wurden PLD-defiziente Mäuse analysiert. Mäuse, denen entweder PLD1 oder PLD2 fehlt, sind lebensfähig, fertil und haben normale Thrombozytenzahlen. Es zeigte sich, dass PLD1 für den induzierbaren Anteil der PLD-Aktivität in Blutplättchen verantwortlich und an der Integrinaktivierung unter statischen Bedingungen beteiligt ist. Des Weiteren ergaben Adhäsionsexperimente unter Flussbedingungen, dass PLD1 für die GPIb-vermittelte Integrinaktivierung von zentraler Bedeutung ist. Folglich sind Mäuse mit einer genetischen Ablation von PLD1 vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt. Da die Blutungszeiten dieser Tiere nicht verlängert waren, könnte die Inhibition von PLD1 einen anti-thrombotischen Therapieansatz darstellen. iii) Die zelluläre Aktivierung von Thrombozyten oder Immunzellen geht mit einem Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration einher. Der sogenannte Speicher-vermittelte Kalziumeinstrom (store-operated calcium entry, SOCE) über die STIM1-Orai1-Achse ist der wichtigste Kalziumeinstrommechanismus in Folge der Stimulation von Rezeptoren mit einem immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) in Mastzellen und T-Zellen. Allerdings ist die Notwendigkeit eines Kalziumeinstroms in Fcg Rezeptor (FcgR)-vermittelten Signalprozessen sowie die Relevanz von STIM2 hierbei noch unklar. Daher wurden gentechnisch veränderte Mäuse, denen zentrale Moleküle des SOCE-Apparats fehlen, untersucht. Kalziummessungen zeigten, dass beide STIM-Isoformen an der Kalziummobilisierung in Folge der T-Zellrezeptorstimulation beteiligt sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Stimulation von FcgRs zu SOCE führt, der von STIM1 und vermutlich auch von Orai1 vermittelt wird. Die Daten aus dem Immunthrombozytopenie (ITP) Tiermodell belegen, dass SOCE für die Zerstörung von Plättchen essentiell ist. Weiterhin sprechen die hiervorliegenden Ergebnisse für eine Rolle beider STIM Isoformen in der Pathologie der ITP. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass STIM1 und Orai1 entscheidende Faktoren für IgG-vermittelte systemische Anaphylaxie sind. STIM2 ist ebenfalls an der IgG-vermittelten, nicht jedoch an der IgE-vermittelten Anaphylaxie beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Eingriffe in den SOCE eine neue Strategie in der Behandlung von IgG-abhängigen immunologischen Erkrankungen sein könnten.…