Christine Erk

• Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Metabolismus sowie der Reaktivität verschiedener Wirk- und Arzneistoffe mittels flüssigchromatographischer und massen-spektrometrischer Methoden, sie gliedert sich dabei in vier Projekte. Zur Bestimmung des Metabolitenprofils wurde ein passendes In-vitro-Inkubationssystem mit Cytochrom-P-450-Systemen entwickelt. So wurden der Metabolismus und die Pharmakokinetik der Mip-Inhibitoren SF110, SF235 und SF354 gegen Legionellen, sowie neuer antitrypanosomaler Verbindungen MB209, MB343 und MB444 undDiese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Metabolismus sowie der Reaktivität verschiedener Wirk- und Arzneistoffe mittels flüssigchromatographischer und massen-spektrometrischer Methoden, sie gliedert sich dabei in vier Projekte. Zur Bestimmung des Metabolitenprofils wurde ein passendes In-vitro-Inkubationssystem mit Cytochrom-P-450-Systemen entwickelt. So wurden der Metabolismus und die Pharmakokinetik der Mip-Inhibitoren SF110, SF235 und SF354 gegen Legionellen, sowie neuer antitrypanosomaler Verbindungen MB209, MB343 und MB444 und von Daptomycin bestimmt. Darüber hinaus wurde die antibakterielle Aktivität des Daptomycins gegenüber einem unbekannten Staphylokokkus-Stammes S. sciuri ermittelt. Außerdem wurden Reaktivitätsuntersuchungen neu synthetisierter Inhibitoren gegen Tuberkulose und S. aureus durchgeführt. Die untersuchten Mip-Inhibitoren lieferten ein Metabolitenprofil, welches durch Ester- und Amidhydrolysen sowie Hydroxylierungen geprägt wurde. Die Verbindung SF110 schien dabei bereits eine gewisse Instabilität der Esterbindung aufzuweisen, da auch im Blindwert entsprechende Spaltprodukte identifiziert werden konnten. Die Hauptmetabolite von SF235 und SF354 bildeten sich durch unterschiedliche Hydrolysen, da die Spaltung des Moleküls von den jeweiligen Substituenten abhängig ist. Innerhalb dieser Substanzklasse dominiert die mikrosomale Enzymkatalyse, da der größte metabolische Umsatz sowie die meisten Metabolite mittels mikrosomaler Fraktion des Menschen bzw. der Maus gefunden wurden. Die Klasse der Mip-Inhibitoren wird somit vor allem durch Cytochrom-P-450-Enzyme umgesetzt, wobei die Hydrophilie durch Einführung polarer OH-Gruppen der Moleküle erhöht wird. Die Hydroxylierung scheint dabei positionsspezifisch, bedingt durch sterische Hinderungen oder dirigierende Einflüsse, abzulaufen. Stabilitätsvergleiche zwischen SF110, SF235 und SF354 zeigten, dass die Einführung einer Amidbindung anstelle der korrespondierenden Esterbindung die Substanzklasse maßgeblich metabolisch stabilisiert. Im Rahmen des murinen In-vivo-Metabolismus wurde beobachtet, dass SF235 einem deutlich stärkeren Metabolismus unterlag als SF354 und sich der Metabolismus vor allem innerhalb der ersten 30 min vollzog. Demgegenüber zeigten die In-vitro-Ergebnisse gegenteilige Ergebnisse, bei denen SF354 die am stärksten metabolisierte Substanz war. Diese widersprüchlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass In-vitro-Modelle nur als Anhaltspunkt verwendet werden sollten, um mögliche Trends abzuleiten. Metabolismusstudien der Chinolonamide, die gegen die afrikanische Schlafkrankheit wirken sollen, veranschaulichten, dass die größte enzymatische Umsetzung aller drei getesteten Verbindungen mittels cytosolischer Fraktion erfolgte. Die Enzymreaktionen werden vermutlich durch ALDH bzw. MAO dominiert und nicht durch CYP bzw. FMO. Die gebildeten Metabolite in den verschiedenen Fraktionen unterlagen (ω-1)-Oxidationen, N-Desalkylierungen, Amidhydrolysen und aromatischen Hydroxylierungen. Auffallend war, dass eine Hydroxylierung am aromatischen Benzylring nur erfolgen konnte, sofern der Benzylaromat keinen Fluorsubstitutenten trug, da dieser desaktivierend wirkte. Die aromatische Hydroxylierung am Chinolonamid erfolgte dagegen bei allen drei Substanzen. Es wurde somit lediglich eine Hydroxylierung am Benzylring von MB343 festgestellt. Die enzymatische Aktivität aller Substanzen folgte einer Reaktionskinetik 1. Ordnung. Die unterschiedlichen Stabilitäten der Substanzen zeigten einen deutlichen Trend: MB209 wurde, da es die instabilste Verbindung darstellt, im größten Maße umgesetzt, gefolgt von den stabileren Derivaten MB343 und MB444. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivitäten zeigte, dass die drei Substanzen, verglichen mit der Leitstruktur GHQ168, eine um den Faktor zehn geringere Aktivität aufwiesen [19]. Aufgrund der eingeführten Fluoratome weisen die Substanzen somit eine wesentlich höhere Stabilität auf. Diese Ergebnisse wurden durch die Untersuchung der Halbwertszeit bestätigt, bei der MB444 den höchsten Wert besaß. Weiterhin ist die Position des Fluorsubstituenten am Chinolongerüst ausschlaggebend für die metabolische Stabilität, wobei MB444 aufgrund des para-Fluorsubstituenten am Chinolonamid die stabilste Verbindung darstellt. Durch Inkubation von Daptomycin mit unterschiedlichen S. sciuri-Isolaten wurde ein möglicher Inaktivierungsmechanismus beobachtet, bei dem das Antibiotikum durch Spaltung des cyclischen Aminosäureringes, durch Deacylierung des Fettsäureschwanzes, einer Kombination beider Mechanismen oder durch eine Spaltung des heteroaromatischen Ringsystems von Tryptophan inaktiviert wurde. Die Proteasen des Daptomycin-resistenten S. sciuri-Isolats TS92 führten zu einem Daptomycinabbau von 35 %, unabhängig von der eingesetzten Menge des Arzneistoffes. Das Ausmaß des Abbaus scheint darüber hinaus vom eingesetzten Inkubationsmedium abhängig zu sein, da die Proteasen voraussichtlich auf ein bestimmtes Nährmedium angewiesen sind. Der sensitive S. sciuri-Stamm TS93 lieferte die höchste Abbaurate an Daptomycin mit 55 % und widerlegt damit die Vermutung, dass Daptomycin die geringste antibakterielle Aktivität gegenüber diesem S. sciuri-Stamm aufweist. Im In-vitro-Metabolismus zeigte Daptomycin insgesamt eine sehr geringe Umsetzungsmenge mit maximal 5 % nach 4 h und einer geringen Metabolitenbildung. Hier wurde nur ein Metabolit gefunden, welcher auch mittels S. sciuri-Inkubation identifiziert wurde. Dieser Mechanismus könnte somit auf anderem Wege verlaufen. Die Reaktivitätsstudien der kovalenten Inhibitoren der FadA5-Thiolase gegen Tuberkulose zeigten, dass nur die Verbindungen C1 und C4 eine Reaktivität gegenüber der Aminosäure Cystein93 im aktiven Zentrum besaßen, die somit für den gewünschten Einsatzzweck geeignet sein könnten. Weiterhin wurde bei den kovalenten Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase mit dem Enzym FabI, welches im aktiven Zentrum ein Tyrosin besitzt, keine Reaktion festgestellt, da keine Addukte identifiziert wurden. Dies ist vermutlich auf die Unlöslichkeit im verwendeten TRIS-Puffer zurückzuführen.…
• This work deals with the investigation of the metabolism as well as the reactivity of different drug candidates as well as active pharmaceutical substances by means of liquid chromatographic and mass spectrometric methods. It is divided into four projects. In order to determine the metabolite profile, a suitable in-vitro incubation system using cytochrome P-450-systems was developed. Thus, the metabolism and pharmacokinetics of the Mip inhibitors SF110, SF235, and SF354 against Legionella, as well as of new antitrypanosomal compounds MB209,This work deals with the investigation of the metabolism as well as the reactivity of different drug candidates as well as active pharmaceutical substances by means of liquid chromatographic and mass spectrometric methods. It is divided into four projects. In order to determine the metabolite profile, a suitable in-vitro incubation system using cytochrome P-450-systems was developed. Thus, the metabolism and pharmacokinetics of the Mip inhibitors SF110, SF235, and SF354 against Legionella, as well as of new antitrypanosomal compounds MB209, MB343, and MB444 and of daptomycin were determined. In addition, the antibacterial activity of daptomycin against an unknown Staphylococcus strain S. sciuri was determined. In addition, reactivity studies of newly synthesized inhibitors against tuberculosis and S. aureus were performed. The Mip inhibitors investigated showed a metabolite profile being characterized by ester and amide hydrolysis as well as hydroxylation. The ester moiety of compound SF110 seemed to be unstable, as metabolites could be also identified in the negative control. The major metabolites of SF235 and SF354 were formed by different hydrolyses, whereby the cleavage mechanism of the molecule is dependent on the respective substituents. The substance class is dominated by microsomal enzyme catalysis, as the highest metabolic turnover and, eventually, the most metabolites were found using a microsomal fraction of the human and mouse. The class of Mip inhibitors is thus represented mainly by cleavage due to cytochrome P-450 enzymes, wherein the hydrophilicity of the substrate is increased by introducing polar hydroxyl groups. Hydroxylation seems to be site specific due to steric hindrance or directing influences. Comparing the stability of SF110, SF235, and SF354 revealed that introducing an amide bond instead of an ester bond significantly stabilizes the substance class metabolically. In murine in vivo metabolism results, SF235 was found to be metabolized more significantly than SF354 within the first 30 min of incubation. In contrast, the in vitro results showed the opposite. SF354 was the most metabolized substance. The contradictory results suggest that in vitro models should only be used as an indicator to derive possible trends. Metabolism studies of quinolonamides active against African sleeping sickness, demonstrated that the highest enzymatic conversion of all three tested compounds was caused by the cytosol fraction. The enzyme reactions are probably catalyzed by ALDH or MAO and not by CYP or FMO, respectively. The formed metabolites found in various fractions were subject to (ω-1)-oxidations, N-dealkylations, amide hydrolyses, and hydroxylations. It was observed that hydroxylation could only take place on the aromatic benzyl ring if it did not carry any fluorine substituents having a deactivating effect. The aromatic hydroxylation of the quinolonamide, however, was carried out in all three substances. Thus, only hydroxylation on the benzyl ring of MB343 was observed. The enzymatic activity of all substances followed a first-order kinetic. The different stabilities of the substances had a clear trend: MB209 showed the highest enzymatic activity as it represents the most unstable compound, followed by MB343 and MB444. The enzymatic activities of the three substances were ten times lower compared to the enzymatic activity of lead structure GHQ168 [19], which exhibits a much higher stability due to the fluorine atoms. These results were confirmed by a half-life study in which MB444 was the most stable compound. The position of the fluorine substituent on the quinolone determines the metabolic stability, making MB444 the most stable compound because it carries a p-fluorine substituent on the quinolonamide. When incubating Daptomycin with different S. sciuri isolates, a possible inactivation mechanism of the antibiotic agent was observed in which the cyclic amino acid ring was opened, the fatty acid tail deacylated, or a combination of both mechanisms as well as the heteroaromatic ring system of tryptophan was cleaved. The proteases of the daptomycin-resistant S. sciuri isolate TS92 led to a daptomycin degradation of 35%, regardless of the initial concentration used. The degradation also seems to depend on the incubation medium since the proteases probably rely on a specific nutrient medium. The sensitive S. sciuri strain TS93 showed the highest degradation rate of daptomycin with 55 % and thus refutes the assumption that it has the smallest antibacterial sensitivity against daptomycin. Overall, DAP showed a very low in vitro metabolism with a conversion rate of maximum 5% after 4 h and a low metabolic rate. Here, only one metabolite could be found which was also identified by means of S. sciuri incubation. Thus, this mechanism could proceed in a different way. The reactivity studies of the covalent inhibitors of the thiolase of the FadA5 enzyme against tuberculosis showed that only compounds C1 and C4 targeted cysteine93, thus being suitable for the desired purpose. Furthermore, no reaction was observed for in the covalent inhibitors of the enoyl-ACP reductase with the enzyme FabI, which carries a tyrosine in the active site, since no adducts were identified. This is probably due to the insolubility in the TRIS buffer.…