Tomáš Racek

• Immunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das GrünImmunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das Grün fluoreszierende Protein (GFP)-Transgen enthalten. Die Infektion mit dem VSV-G pseudotypisierten HIV-1-Vektor pGJ2 führte in allen getesteten Zelllinien und auch in primären humanen und murinen Zellen zur Transgenexpression. Ebenfalls konnte eine direkte Expression des Transgens in vivo nachgewiesen werden. Balb/c-Mäuse wurden in einem Vektoren- oder DNA-Prime und Vektoren-Boost-Verfahren immunisiert und die humorale und zelluläre Immunantwort wurde untersucht. Die Primärimmunisierung mit DNA und Boosting mit den lentiviralen Vektoren induzierte eine Gag-spezifische humorale Immunantwort, hohe Titer von VSV-G-neutralisierenden Antikörpern und eine Gag- und EGFP-spezifische zytotoxische T-Zell-Antwort. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl Strukturbestandteile des lentiviralen Vektors als auch die Transgenexpression zur Aktivierung der Immunantwort beitrugen. So machen die einzigartigen biologischen und immunologischen Eigenschaften der replikationsdefizienten HIV-Vektoren aus diesen Konstrukten wertvolle Werkzeuge, um weiter die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen HIV-Infektion und Krankheit bedeutsam sind, zu studieren. Im Rahmen der hierzu durchgeführten Arbeiten wurden außerdem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektoren hergestellt und analysiert. Um die Transkription der lentiviralen Vektor-Kassette durch das Vacciniavirus zu ermöglichen, wurde vor den Transkriptionsstart ein Vaccinia-Promotor gesetzt und an das 3’-Ende das Transkription-Stoppsignal angehängt. Obwohl die genomische Analyse eine erfolgreiche Herstellung der Hybridvektoren bestätigen konnte, muss die Produktion der lentiviralen Vektoren nach der Vaccinia-Infektion weiter optimiert werden. Nichtsdestotrotz könnte die Kombination von replizierenden Vacciniaviren und replikationsinkompetenten HIV-Vektoren ein neuartiges Impfkonzept darstellen. Die Expression von HIV-Strukturgenen würde in der ersten Phase der Infektion mit dem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektor zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen. Die Bildung von lentiviralen Vektoren würde diese Immunantwort weiter boosten, und falls die lentivirale Vektorkassette dann ein entsprechendes Transgen enthalten würde, würde dies weiter die Immunantwort verstärken und vor allem könnte diese Art des Impfstoffes eine langzeitige falls nicht dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort erzeugen.…
• Immunogenicity of retroviral and lentiviral vectors has been regarded as a major impediment to the use of these constructs in gene therapy. However, this may be exploited for the design of vaccine candidates against HIV infection and AIDS. To test the specific potential to induce antibody and cytotoxic T lymphocyte responses to HIV-derived vectors, a set of VSV-G-pseudotyped replication-defective vectors that contain a codon-optimized p17/p24 HIV-1 Gag or the green fluorescent protein (GFP) gene as transgene were constructed. Infection with theImmunogenicity of retroviral and lentiviral vectors has been regarded as a major impediment to the use of these constructs in gene therapy. However, this may be exploited for the design of vaccine candidates against HIV infection and AIDS. To test the specific potential to induce antibody and cytotoxic T lymphocyte responses to HIV-derived vectors, a set of VSV-G-pseudotyped replication-defective vectors that contain a codon-optimized p17/p24 HIV-1 Gag or the green fluorescent protein (GFP) gene as transgene were constructed. Infection with the gag or gfp gene-containing vector particles resulted in transgene expression in cell lines and primary human and murine cells. Moreover, the direct transgene expression mediated by this lentiviral vector was also detected after in vivo application. Balb/c mice were immunised in a vector or DNA prime vector boost fashion and humoral and cellular immune responses were examined. Immunisation with DNA as prime, and the lentiviral vectors as boost, induced a Gag-specific antibody response, high titers of neutralising antibodies directed against the VSV-G protein and Gag- and EGFP-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses. CTL responses were induced by both structural proteins contained in the vector preparation and through expression of the transgene. Thus, the unique biological and immunologic properties of single-cycle HIV vectors make the constructs valuable tools to further study immune mechanisms relevant to protection from HIV infection and disease. Moreover, to develop a novel HIV vaccine strategy, recombinant vaccinia viruses that express functional HIV-based vector genomes, were constructed. For this purpose, the proviral lentiviral genome, engineered into the vaccinia virus, was subjected to several modifications, including the replacement of retroviral promoter sequences by vaccinia virus sequences and the precise fusion of the transcription stop signal downstream of the transcription unit, allowing cytoplasmic transcription of distinct full-length lentiviral transcripts. The developed chimeric vector should be able to produce the transduction-competent lentiviral particels after single infection of the host cells. However, the genome analysis confirm the successful construction of vaccinia/HIV hybrid vector, the generation of lentiviral particles after vaccinia infection have to be optimized. Nevertheless, due to the favorable properties of vaccinia vectors, including high coding capacity, stability, and wide host range, vaccinia viral/HIV chimeric vectors can be promising HIV vaccine candidate. The expression of HIV-structural genes would lead in the first phase of the infection with the vaccinia/HIV-1 hybrid vector to strong humoral and cellular immunity. The generation of lentiviral vectors would boost this immune response, especially if the lentiviral vector cassette will contain an appropriate transgene. This kind of the vaccine could induce strong long-term or lasting HIV-specific immune response.…