• search hit 8 of 12
Back to Result List

Lamina assoziierte Polypeptide 2, Lamin-B-Rezeptor und Lamine : Untersuchungen an Vertebratenmodellen

Lamina associated polypeptides 2, lamin B receptor and lamins: investigations on vertebrates

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-11619
  • Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In Säuger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2α und ζ, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2α ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei Säugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 β, γ, ω). Mit Hilfe des “Radiation Hybrid mappings“ wurde das LAP2 Gen auf der “Linkage group“ 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zusätzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des Hühner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), über die Vögel (Huhn), bis zum Säuger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die ω Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und Säugern vorhanden ist: Andererseits ist die α Isoform der Säuger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zusätzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gegen die konservierte aminoterminale Domäne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten Hühner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2β anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine größere Ähnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die α-Isoform eine Neuheit der Säugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons für ein 616 Aminosäure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandomänen in seiner carboxyterminalen Domäne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminosäurenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminosäurensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandomänen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antikörpern gegen die ersten 210 Aminosäuren des zLBRs hergestellt, die für zukünftige immunologische Analysen verwendet werden können. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukleären Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit für die anfängliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Primärsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der Säuger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, dafür aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die Überexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine über das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernhülle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer “antisense-“ Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen Fällen innerhalb der ersten 24 Stunden vollständig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverzögerung und unterschiedlich starke Entwicklungsstörungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden Fällen maternale Proteine, wie das LA2ω oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten.show moreshow less
  • The nucleus is an essential organelle of eucaryotic cells and separated by a double membrane, the nuclear envelope, from the cytoplasm. Using the zebrafish as one model organism and also cultured cells of various vertebrates, analysis of integral (lamina associated polypeptide 2, lamin B receptor) and peripheral membrane proteins (lamins) of the inner nuclear membrane were performed. One of the best investigated protein of the inner nuclear membrane is the lamina associated polypeptide 2. By alternative splicing the LAP2 gene encodes a numberThe nucleus is an essential organelle of eucaryotic cells and separated by a double membrane, the nuclear envelope, from the cytoplasm. Using the zebrafish as one model organism and also cultured cells of various vertebrates, analysis of integral (lamina associated polypeptide 2, lamin B receptor) and peripheral membrane proteins (lamins) of the inner nuclear membrane were performed. One of the best investigated protein of the inner nuclear membrane is the lamina associated polypeptide 2. By alternative splicing the LAP2 gene encodes a number of isoforms that are expressed in a developmental and tissue specific manner. In mammals 6 different isoforms (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) are known, and all of them except for LAP2α and LAP2ζ get integrated into the inner nuclear membrane. LAP2α is predominantly found in the nucleoplasm and has so far only been described in mammals. Due to the identification of the genomic clone ICRFc 7101293Q5 (RZPD) and an additional contig-sequence published by a database of the Sanger Institute, I was able to analyse the genomic structure of the zebrafish lamina associated polypeptide 2 (zLAP2) gene. It spans approximately 19 kb (with no regulatory sequences) and contains 15 exons. By alternative splicing the 15 exons encode 3 isoforms (zLAP2 β, γ, ω). Using the method of “radiation hybrid mapping” the zLAP2 gene could be localised onto the linkage group 4 between the EST-markers fc01g04 (213,97) and fb49f01 (215,69cR). The additional identification of the genomic LAP2 sequence of chicken, made it possible to compare the genomic sequences of lower vertebrate LAP2 (zebrafish), avian LAP2 (chicken) and mammal LAP2 (human). This comparison revealed that the zebrafish LAP2ω was not found in the chicken and the mammalian genome. On the other hand sequences encoding a LAP2α isoform were not detected in the chicken and zebrafish genome. The analysis of total proteins of 10 day old chicken embryos and fibroblasts using monoclonal and polyclonal antibodies raised against the evolutionary conserved aminoterminal domain confirmed the abundance of a LAP2α isoform. The predominant isoform detected was comparable to LAP2β of other species. These results suggest, in addition to the fact that the exons of human LAP2 show a higher identity to the exons of the chicken LAP2 than to the exons of the zebrafish LAP2, that the α Isoform is a novelty of mammals. A second integral membrane protein, which I focused on, is the lamin B receptor of zebrafish(zLBR). By using radioactive labelled probes of a previously identified LBR fragment, I was able to identify to clones that were coding for the cDNA- (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) and the genomic sequence (ICRFc71M10137Q5 (RZPD). By further computer analysis a genomic sequence was determined and revealed that the LBR gene spans over 12 kb nucleotides (no regulatory sequences included). The gene contains 13 exons and encodes a protein of 616 amino acids. Comparable to other species the zLBR contains 8 transmembrane domains in its carboxyterminal domain. Comparison of LBRs of different species on the amino acid level demonstrated that the aminoterminal region and the carboxyterminal domain are highly conserved. Especially the carboxyterminal domain coding for the membrane spanning domains exhibited a high conservation. Furthermore polyclonal antibodies, specific for the amino acids 1-210 were raised and can be used for immulological analysis in the future. Comparable to integral membrane proteins of the inner nuclear membrane lamins are also essential for nuclear processes. A main feature of B type lamins is the carboxyterminal CxxM-motif. This motif undergoes a posttranslational isoprenylation and is responsible for the correct targeting and initial association of the lamins to the inner nuclear membrane. A type lamins on the other and do not possess a CxxM-motif in the primary sequence (mammalian lamin C, C2). In the lamin A isoform the CxxM-motif is encoded in the primary structure but gets proteolytically removed after the protein was targeted to the lamina. The lamin C2, a meiotic splice variant of lamin A, demonstrates a peculiarity. It does not encode a CxxM-motif but possesses the hexapeptide GNAEGR at its aminoterminal end. The GNEAGR-sequence also undergoes a posttranslational modification and becomes myristoylated. Functional studies using overexpressed GFP-fusion proteins of different wildtype lamins and lamin mutants demonstrated that both the CxxM motif and the GNAEGR motif promote nuclear membrane proliferation. With the help of specific antisense oligonucleotides, known as "Morpholinos", I was able to block the expression of LAP2, LBR and B-type lamins B1 and B2 in zebrafish embryos. The mRNA translation of each gene was block completely for at least 24 hours after fertilisation. Although only few embryos were investigated I realised an obvious delay in development and developmental defects in different degrees in all analysed embryos. The degree of morphological deformations was more obvious in knock downs of LBR, than after the reduction of LAP2 or the B type lamins, where maternal proteins, like LAP2ω and the B Type lamin LIII could not get reduced.show moreshow less

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar Statistics
Metadaten
Author: Kristina Prüfert
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-11619
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Biologie
Faculties:Fakultät für Biologie / Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Date of final exam:2005/01/19
Language:German
Year of Completion:2004
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
GND Keyword:Wirbeltiere; Kernhülle; Membranproteine
Tag:CxxM-Motiv; Kernmembran; LAP2 alpha; Zebrafisch LBR
CxxM-motif; LAP2 alpha; nuclear envelope; zebrafish LBR
Release Date:2005/02/01
Advisor:Prof. Dr. Georg Krohne