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Fanconi Anämie : Entwicklung von hämatopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2)

Fanconi Anämie : Development of hematopoetic mosaicism and functional studies of FANCO (RAD51C) and FANCN (PALB2)

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836
  • Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowieZur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bbshow moreshow less
  • For maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumorFor maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumor rates and anemia at a juvenile age. Knowing the affected gene only lim-ited conclusions could be considered of the phenotypical appearance. More likely the kind of mutation and the affected position within the gene seems to correlate with the severity of the disease. Over the time an elevated number of patients with mild phenotype were observed. One possible explanation may be mild mutations another a mosaic state developed within the blood forming cells. The latter was caused by rever-sion of one of both mutations. This kind of “natural gene therapy” was observed in the blood of 10 up to 30 % FA- patients. To get better insights in to the mosaic development we investigated different cell lines of five patients aged between 11 (pat. 5) and 33 (pat. 4) years. Both FA-A patients (pat. 1, 2) were described as mosaic patients before by Gross et al. 2002. The other patients arouse suspicion for developing mosai-cism by different aspects like normal blood counts, MMC tolerant lymphoblastiode cell lines and analyzing gDNA from blood. Detailed analyses confirmed the reversion of one mutation in blood of the FA-D2 patients (pat. 4, 5). In common for all four mosaic was the kind of reversion, a back mutation (pat. 1: c.971T>G, pat. 2: c.856 C>T, pat. 4: c.3467-2A>G, pat. 5: c.3707G>A) mostly in or near by a mutation motive. To get insights in to the mosaic state of the patients’ blood cells, gDNA, chromosomal breakage and cell cycle analyses were performed and blood cell counts of thrombo-, mono-, granulo-, lymphocytes and haemoglobin were observed for several years. Chromosomal breakage analyses of t-lymphocytes met-aphases (pat. 4, 5) treated with MMC showed a mosaicism typical bimodal distribution. The only moderate increased chromosomal breakage rate in metaphases of patient 1 points out a strong pronounced reversion. For better estimation of the Mosaic state in patient blood we performed cell cycle analysis with mixtures of FA- and non FA-blood. Thereby we observed the border for mosaic detection at a degree of 30 % cells with spontaneous /MMC induced G2-phase arrest. Compared to the mixing study reversion degrees of 0 % (pat. 4) up to 90-95 % (pat. 2) were assumed for four of the patients. At molecular base gDNA analyses of MACS sorted T-/ B- lympho, mono and granulocytes as well as from fibroblasts and lymphoblastoide cell lines allowed a more detailed insight in to the mosaic statuses. In all patients we observed different distinct of mosaic state in their blood cell lines. We observed a tendency of correlation between reversion degree and the longevity of blood cells – cells with short life spans (mono-, granulo-, B-lymphoytes) showed higher reversion degrees than log living T-lymphocytes. The fact that we detected the same rever-sion in the different cell lines of a patient suggests a reversion within a common precursor cell. Further we observed, as we know for the first time, a reversion within a bone marrow fibroblast line (pat. 1). Four of our patients showed commonly observed reversions in cultured lymphoblastoide cell lines. With each of the tested methods we could show mosaic development in blood of our patients. Every of them showed pros and cons. For this reason a combination of the different methods would be recommendable for cal-culation of the mosaic state in patient blood. The second project investigated the interactions of FANCO (RAD51C) within the group of the RAD51 paralogs (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) and with RAD51. Interactions were tested by Mammalian Two- and Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Our investigations confirm most of the up to now detected interactions leading to RAD51C-XRCC3-complex (CX3) and RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 com-plex (BCDX2) formation – latter consisting of the subcomplexes RAD51B-RAD51C (BC) and RAD51D-XRCC2 (DX2). M3H analyses give a hint for the importance of the RAD51B protein for the BCDX2 complex formation. The protein seems to be necessary for RAD51C-RAD51D interaction and also to interact, other than intended before, with XRCC2. In turn this interaction seems to be strongly promoted by RAD51D. In M2H and M3H analyses we found evidence of the importance of subcomplex formation for the formation of the whole BCDX2 complex and that the complex may be a circular structure. Addi-tionaly we observed evidence for interdependency between the BCDX2- and the XRCC3- complex pro-teins. Because of the proteins involvement into the double strand lesion repair the effect of MMC induced DNA lesions were tested. MMC treatment leads to different changes of interaction within the subcom-plexes. We observed a decrease of interaction strength between RAD51D and XRCC2 and an increased interaction within the BC-complex. The interaction between RAD51C and FANCN was not detectable in our M2H assay but may be promoted by another protein in M3H analysis. Additionally we tested a RAD51C protein inherited the patient mutation R258H. Only in M3H analysis with pMRAD51D and native RAD51B and with additional MMC treatment reduced interaction strength was detectable compared to the wildtype RAD51C. This underlines the hypomorphic nature of the mutation described before. The third project – the elucidation of the RAD51C protein structure proved to be difficult. We could not isolate and purify enough protein for crystallization, neither by expression within a E.coli or an insect cell system not even by co-expression of the complex partner XRCC3. Electrophoretic mobility shift assays of the CX3 complex with different DNA-structures (ssDNA, open fork, 3’- and 5’- overhang structures) showed preference for the 3’-overhang DNA substrate. This method may be used for further investiga-tions of mutations in patient DNA in future.show moreshow less

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Metadaten
Author: Daniela Endt
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Biologie
Faculties:Medizinische Fakultät / Institut für Humangenetik
Fakultät für Biologie / Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Referee:Prof. Dr. Detlev Schindler
Date of final exam:2016/02/24
Language:German
Year of Completion:2015
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
GND Keyword:Fanconi Anämie; Hämatopoese; Mosaik; Remission; Molekulargenetik
Tag:Fanconi Anämie; Reversion; hämatopoetisches Mosaik
FANCO; RAD51C
Release Date:2016/02/24
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