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Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und -Proteinphosphatase Stp von \(Staphylococcus\) \(aureus\)

Molecular and functional characterization of the serine/threonine protein kinase Stk and Protein phosphatase Stp of \(Staphylococcus\) \(aureus\)

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-176542
  • Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese derStaphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese der Bakterien interferieren. Die Zellphysiologie und Zellwandsynthese wird abhängig von der Wachstumsphase und Umwelt-einflüssen in den Bakterien streng reguliert. Neben den Zweikomponentensystemen sind Serin/Threonin-Proteinkinasen und -Phosphatasen wesentliche Sensoren und Regulatoren der Bakterien. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung bewirken diese beiden Systeme eine Hemmung oder Aktivierung der entsprechenden Zielproteine. Dadurch kann sich die Bakterienzelle an innere und äußere Reize anpassen. In dieser Arbeit wurde die konservierte Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und die Serin/Threonin-Phosphatase Stp von S. aureus untersucht. Die beiden Proteine Stk und Stp haben einen großen Einfluss auf die Signalweiterleitung, den zentralen Metabolismus, die Stressantwort, die Antibiotikaresistenz und die Virulenz von S. aureus. Im ersten Teil dieser Arbeit wird dargelegt, dass Stk und Stp in der bakteriellen Membran lokalisiert sind, dort miteinander interagieren und antagonistisch Zielproteine phosphorylieren bzw. dephospho-rylieren. Die Deletion der Phosphatase Stp bewirkt, dass zahlreiche Proteine in der Zelle permanent phosphoryliert und daher vermutlich nur noch eingeschränkt funktionstüchtig sind. Die ausbleibende Dephosphorylierung der Proteine in der stp-Mutante hat einen dramatischen Effekt auf die Zellwand-synthese und die Virulenz von S. aureus. So hat die stp-Mutante eine verdickte Zellwand und ist weniger virulent als die stk-Mutante und der Wildtypstamm. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals eine Erklärung präsentiert, die die strukturellen Besonderheiten von Stk und deren Auswirkung auf die Zellwandsynthese zusammenführt: In der stp-Mutante akkumulieren Zellwandvorläufer in der Zelle, da vermutlich die entsprechenden Zellwandsyntheseproteine durch Stk-vermittelte Phosphorylierung gehemmt werden. Die Proteine FemXAB nehmen eine zentrale Rolle in der Zellwandsynthese ein, indem sie die Pentaglycin-Interpeptidbrücke des Zellwandvorläufers Pentaglycin-Lipid II syntheti-sieren. Stk wird durch die Bindung seiner extrazellulären Domänen an Pentaglycin-Lipid II aktiviert. In der vorliegenden Arbeit konnte FemX als in vitro Substrat von Stk und Stp identifiziert werden. Die permanente Phosphorylierung von FemX in der stp-Mutante führt zur verminderten Synthese der Pentaglycin-Brücken am Lipid II und infolgedessen zum Einbau von unvollständigen Muropeptiden in den neuen Peptidoglycanstrang. Diese strukturelle Veränderung führt zur Verdickung der Zellwand und folglich zur verminderten Empfindlichkeit gegenüber der Glycyl-Glycinpeptidase Lysostaphin. Neben FemX interagiert Stk mit weiteren Zellwandsyntheseproteinen wie FemAB und einigen Zellteilungsproteinen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Stk das Vorkommen seines extrazellulären Liganden Lipid II detektiert und dementsprechend die Zellwandsynthese über FemX reguliert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand verschiedener Omics-Techniken die stk-, stp- und stk/stp-Mutante im Vergleich zum S. aureus NewmanHG Wildtyp charakterisiert. Dabei zeigten sich teilweise große Unterschiede zwischen der stp-Mutante und den anderen Stämmen. Mit diesen Unter-suchungen konnten Ergebnisse aus anderen Studien bestätigt und mit weiteren Daten untermauert werden. So lässt sich die verminderte Virulenz der stp-Mutante mit der reduzierten Expression und Sekretion von Toxinen wie Hämolysinen und Leukozidinen erklären. Dies führt zu einer verminderten Hämolyse von Erythrozyten und einer verminderten Immunantwort gegen diese Toxine im Infektions-versuch. Stk und Stp phosphorylieren bzw. dephosphorylieren Transkriptionsfaktoren und Antwort-regulatoren von Zweikomponentensystemen, was zu der veränderten Expression und Sekretion der Virulenzfaktoren führt. Die Analyse der Mutanten offenbart, dass Stk ein negativer und Stp ein positiver Regulator der Virulenz in S. aureus ist. Außerdem regulieren Stk und Stp zentrale Aspekte des Metabolismus in S. aureus. So ist die Konzentration an Nukleotidtriphosphaten in der stp-Mutante reduziert, was auf eine verminderte Expression der Gene der Pyrimidinsynthese zurückzuführen ist. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass Stk und Stp wesentliche Aspekte der Zellphysiologie wie die Zellwandsynthese, den zentralen Metabolismus und die Virulenz von S. aureus regulieren.show moreshow less
  • Staphylococcus aureus is a commensal that inhabits the human skin and mucosa. S. aureus causes a large variety of nosocomial and community-acquired infections. Nowadays, it is difficult to treat S. aureus infections because this bacterium has acquired resistance to multiple drugs. Therefore, there is a need for new antimicrobial drugs against S. aureus. The most promising strategy to combat antibiotic resistance is to find novel antibiotics which interfere with the cell physiology and cell wall synthesis pathway. The cell physiology and cellStaphylococcus aureus is a commensal that inhabits the human skin and mucosa. S. aureus causes a large variety of nosocomial and community-acquired infections. Nowadays, it is difficult to treat S. aureus infections because this bacterium has acquired resistance to multiple drugs. Therefore, there is a need for new antimicrobial drugs against S. aureus. The most promising strategy to combat antibiotic resistance is to find novel antibiotics which interfere with the cell physiology and cell wall synthesis pathway. The cell physiology and cell wall synthesis is tightly regulated depending on the bacterial growth phase and environmental influences. In addition to the two-component systems, serine/threonine protein kinases are essential sensors and regulators of bacteria. By phosphorylation and dephosphorylation, these systems cause inhibition or activation of the corresponding target proteins. This allows the bacterial cell to adapt to internal and external stimuli. In this work, the conserved serine/threonine protein kinase Stk and the phosphatase Stp in S. aureus were investigated. The two proteins Stk and Stp influence signal transduction, central metabolism, stress response, antibiotic resistance and virulence of S. aureus. In the first part of this work it is shown that Stk and Stp are localized in the bacterial membrane, where they interact with each other and phosphorylate or dephosphorylate target proteins antagonistically. The deletion of the phosphatase Stp leads to numerous proteins in the cell being permanently phosphorylated, which renders them partially unfunctional. The lack of protein dephosphorylation in the stp mutant has a dramatic effect on cell wall synthesis and virulence of S. aureus. Thus, the stp mutant has a thickened cell wall and is less virulent than the stk mutant and the wild-type strain. This work brings together the structural characteristics of Stk and their effect on cell wall synthesis for the first time. In the stp mutant, cell wall precursors accumulate in the cell, presumably because the corresponding cell wall synthesis proteins are inhibited by Stk-mediated phosphorylation. The proteins FemXAB play a key role in cell wall synthesis by synthesizing the pentaglycine interpeptide bridge of the final cell wall precursor pentaglycine lipid II. The pentaglycine lipid II is bound by the extracellular domains of Stk, thereby activating Stk. In the present work, FemX was identified as an in vitro substrate of Stk and Stp. The permanent phosphorylation of FemX in the stp mutant leads to inhibited synthesis of the pentaglycine bridges on the lipid II and consequently to the incorporation of incomplete muropeptides into the new peptidoglycan strand. This structural change leads to thickening of the cell wall and consequently reduced sensitivity to the glycyl-glycine peptidase lysostaphin. In addition to FemX, Stk interacts with other cell wall synthesis proteins such as FemAB and some cell division proteins. These results illustrate that Stk detects the presence of its extracellular ligand lipid II. This leads to an inhibition of FemX and a downregulation of the cell wall synthesis pathway. In the second part of this work, the stk, stp and stk/stp mutants were characterized by different omics- techniques in comparison to the S. aureus NewmanHG wild-type. There were some major differences between the stp mutant and the other strains. With these investigations, results from other studies were confirmed and substantiated with further data. Thus, the reduced virulence of the stp mutant can be explained by the reduced expression and secretion of toxins such as hemolysins and leukocidines. This leads to a reduced hemolysis of erythrocytes and a reduced immune response to these toxins in the infection experiment. Stk and Stp phosphorylate or dephosphorylate transcription factors and response regulators of two-component systems resulting in altered expression and secretion of virulence factors. Analysis of the mutants reveals that Stk is a negative and Stp is a positive regulator of virulence in S. aureus. In addition, Stk and Stp regulate central aspects of S. aureus metabolism. Thus, the concentration of nucleotide triphosphates in the stp mutant is reduced, which is due to a reduced expression of the genes of pyrimidine synthesis. From these results it becomes clear that Stk and Stp regulate essential aspects of cell physiology such as cell wall synthesis, central and virulence in S. aureus. This study of the function of Stk and Stp contributes significantly to the understanding of regulatory processes by phosphorylation in the bacterial cell.show moreshow less

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Metadaten
Author: Marcel Jarick
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-176542
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Graduate Schools
Faculties:Graduate Schools / Graduate School of Life Sciences
Referee:PD Dr. Knut Ohlsen, PD Dr. Wilma Ziebuhr, Prof. Dr. Susanne Engelmann
Date of final exam:2019/02/08
Language:German
Year of Completion:2020
DOI:https://doi.org/10.25972/OPUS-17654
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
GND Keyword:Kinase; Phosphatase; Stk; Stp; Staphylococcus
Tag:FemX; Zellwand
Release Date:2020/02/10
Licence (German):License LogoCC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International