Dominic Graf

• After implementing a reliable mass spectrometry based kinetic study the indole conjugation with different organometallic indoles led to questions about the electronical and sterical influences on reactivity. The substitution pattern of the ferrocene functionalized indoles at the six-membered ring determines the electron density on the C3 atom, which reacts with the formed Schiff base. Since the experimental results showed the exact opposite trend, covalent docking studies were performed elucidating the importance of surface interactions. TheseAfter implementing a reliable mass spectrometry based kinetic study the indole conjugation with different organometallic indoles led to questions about the electronical and sterical influences on reactivity. The substitution pattern of the ferrocene functionalized indoles at the six-membered ring determines the electron density on the C3 atom, which reacts with the formed Schiff base. Since the experimental results showed the exact opposite trend, covalent docking studies were performed elucidating the importance of surface interactions. These studies were in harmony with the experimental results and determined lysine 33 as most preferable conjugation site as well as substitution in 6-position as most favourable pattern. The amine motif in compounds 6, 7 and 8 proofed to be easily fragmented by the ESI method used. The amide linker in 10 remains intact but shows a lower conversion. Those two inherent characteristics are however preferable for well-defined and site-specific bioconjugation. The synthesis and evaluation of piano stool complex derivatives with manganese and rhenium metal centre 15, 16, 18 and 22 gave additional guidance by the interpretation of applicable structural motifs. The electron-withdrawing carbonyl groups lead to the hindrance of fulvene formation and thus to no fragmentation as seen with the ferrocene group. The total conversion is low compared to 8, only 22 shows a good enough conversion to mainly monoconjugate of 45% and a possible radio-labelling application as 99mTc analogue. As consequence manganese complexes with a stable facial tricarbonyl unit and a tridentate chelator with 4-, 5- and 6-substituted aminomethylindole conjugated through an amide bond were synthesized and consecutively evaluated. The resulting organometallic indole derivatives 29, 30 and 31 all showed a total conversion around 40% similar to 16, but at the same time a rate constant in the range of 10-4 s-1 like the organic indole. Besides the similar conversion, the rate constants followed the trend of the 6-substituted derivative as fastest and then 5- and 4- substituted derivative with decreasing reactivity. For underlining the usage as technetium label for the best out of the series 31, a rhenium analogue was prepared. The resulting compound 32 was especially interesting, because the conversion was even higher than the 70% of 8 with a total of 88%. Additionally, the rate constant was a tenfold higher as well. This rendered compound 32 as best possible 99mTc analogue for further application as radio-label. After the success of 32 and realizing the sterical benefits resulting from the flexible tridentate ligand-system, substitution at the five-membered ring was explored. The complexes 33, 34 and 35 are based on indole-2-carboxylic acid and with the difference of the length of the alkyl spacer between amide and complex to probe for the influence and sterical hindrance, but all three derivatives showed no conjugation which excludes functionalization in 2-position. As the C3 is used for the actual bioconjugation, the last possible derivatization was realized on the indole-N1 by using 1-(3-bromopropyl)indole as building block during the synthesis of the ligand-system. The corresponding manganese 36 and rhenium 37 complexes both showed similar properties of a moderate conversion like 22 and a rate constant in the range of 10-5 s-1. In conclusion the rhenium complex 32 with the 6-substitution pattern at the tridentate indole-bearing ligand remains the most promising structure. The here developed liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay for the determination of inhibitory activity of drug candidates against the 3CLpro of the sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 was successfully implemented and especially designed to give, due to the available absorption spectra and corresponding mass traces, further insight in the otherwise through fluorescence resonance energy transfer-based assays neglected influences on the inhibition results. Starting with a literature-known quinolone containing covalent inhibitor 42 an N1-methylated derivative 43 and their analogues 44 and 45 in which the benzoic acid was exchanged for ferrocene carboxylic acid were synthesized. The inhibition of 3CLpro was evaluated by the concentration of initial 15mer peptide left after incubation and for that purpose the for 280 nm defined molar attenuation coefficient of (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 determined and used. The results showed a reaction of DL dithiothreitol with the less stable benzoic acid esters leading to a moderate inhibitory effect. The methylation in N1-position showed an increase in stability. The methylated and with ferrocene carboxylic acid functionalized derivative showed a complete inhibition during the timeframe of the assay. In search of a fluorescent and therefore traceable inhibitor, 4 hydroxycoumarin was used to synthesize the analogue with benzoic acid 49 and ferrocene carboxylic acid 50. Both derivatives were less stable than their analogues but exhibited the same trend of a more stable ferrocene-derived compound, which exerted a higher inhibition as well. After preparing and testing the model thioester 53 and showing an inactivation of the established inhibitor ebselen, it was concluded that the reaction with DL dithiothreitol reduces the concentration of active intact inhibitor and therefore decreases the inhibition rate during the assay. The next step was proofing the reducing agent as non-essential for the fast assay conducted in a timeframe of 5 min to circumvent the negative influence of DL dithiothreitol. By excluding every inhibition-altering part, the resulting method is the perfect tool for precise statements in relation of inhibitory activity. Then the inhibition assay was repeated for ebselen and the best out of the here introduced organometallic inhibitors 45. Both give equivalent results of a complete inhibition during the measurement. The implemented liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay has many advantages over the fluorescence resonance energy transfer-based assays in which all the information and insight accumulated by the evaluation of uv/vis traces and mass spectra are not available leading to wrong or deviating results regarding the inhibitory capacity of inhibitor candidates.…
• Nach der erfolgreichen Implementierung einer auf Massenspektrometrie basierenden Methode, um kinetische Studien über die Indolkonjugation durchzuführen, kamen Fragen über die elektronischen und sterischen Einflüsse auf die Reaktivität auf. Das Substitutionsmuster der Ferrocen-funktionalisierten Indole am sechsgliedrigen Ring bestimmt die Elektronendichte am C3-Atom, welches wiederum mit der zuvor entstandenen Schiffbase reagiert. Da die experimentellen Daten einen der Elektronendichte entgegengesetzten Trend aufwiesen, wurden Docking-StudienNach der erfolgreichen Implementierung einer auf Massenspektrometrie basierenden Methode, um kinetische Studien über die Indolkonjugation durchzuführen, kamen Fragen über die elektronischen und sterischen Einflüsse auf die Reaktivität auf. Das Substitutionsmuster der Ferrocen-funktionalisierten Indole am sechsgliedrigen Ring bestimmt die Elektronendichte am C3-Atom, welches wiederum mit der zuvor entstandenen Schiffbase reagiert. Da die experimentellen Daten einen der Elektronendichte entgegengesetzten Trend aufwiesen, wurden Docking-Studien durchgeführt, um die Einflüsse der Wechselwirkungen mit der Proteinoberfläche näher zu beleuchten. Diese entsprachen den experimentellen Werten und zeigten, dass Lysin 33 die bevorzugte Konjugationsstelle ist und dass die Substitution in 6-Position die energetisch günstigste darstellt. Das sekundäre Amin der Verbindungen 6, 7 und 8 wurde unter den ESI-Bedingungen leicht fragmentiert. Die Amid-Bindung von 10 dagegen bleibt intakt und ein langsamerer Umsatz, welcher für einen wohl definierten Umsatz sorgt, wurde beobachtet. Die Synthese und Evaluation der Halbsandwich-Komplexe 15, 16, 18 und 22 gab zusätzlichen Aufschluss über die strukturellen Einflüsse. Die elektronenziehenden Carbonyle behindern die Bildung der Fulvene, welche für die Ferrocen-Derivate beobachtet worden war. Der Gesamtumsatz ist vergleichsweise gering und nur Substanz 22 zeigt eine annehmbare Konversion von 45% an Monokonjugat auf, welches sie wiederum für den Einsatz als 99mTc-Analog qualifiziert. Als direkte Konsequenz wurden Mangankomplexe mit einer stabilen facialen Tricarbonyl-Einheit und einem Indol beinhaltenden tridentaten Liganden synthetisiert. Dies wurde für die 4-, 5- und 6-Substitution durchgeführt um die Komplexe 29, 30 und 31 zu erhalten. Alle drei zeigten eine Konversion von ungefähr 40% und lagen mit einer Ratenkonstante von 10-4 s-1 in dem Bereich des organischen Indols. Die Ratenkonstanten folgten hingegen wiederum dem Trend der begünstigten 6-Position, gefolgt von der 5- und dann 4-Position. Um einen Verglich zu einer analogen Technetium-Verbindung zu ziehen wurde der beste Komplex 31 als Rhenium-Analog 32 hergestellt. Dies wies den bisher höchsten Gesamtumsatz von 88% auf, welches die Konversion von 70% der Verbindung 8 überschritt. Dadurch qualifizierte sich Verbindung 32 als beste Option für eine Umsetzung als Radiomarker. Nach den Erkenntnissen über die begünstigte Sterik der flexiblen tridendaten Liganden wurde versucht den Erfolg auf den Fünfring zu übertragen. Eine auf Indol-2-säure basierende Reihe an Komplexen (33,34,35) mit unterschiedlich langen Alkyl-Ketten zwischen Indol und Metallkomplex sollte Aufschluss über den sterischen Anspruch geben, allerdings war keine Konjugation für alle drei Derivate zu beobachten. Als Konsequenz wurde die 2-Position für weitere Funktionalisierung nicht weiter berücksichtigt. Die letzte verbliebene Stelle war das Indol-amin selbst, welche durch den Einsatz von 1-(3-bromopropyl)indol bei der Ligandensynthese erfolgreich alkyliert wurde. Der resultierende Mangan- 36 und Rhenium-Komplex 37 zeigten eine mit 22 vergleichbare moderate Konversion und um eine Größenordnung kleinere Ratenkonstante. Durch diese Erkenntnisse verblieb der Rhenium-Komplex 32 weiterhin der beste Kandidat für eine Umsetzung als radioaktiver Marker. Der hier beschriebene liquid chromatography coupled mass spectrometry basierte Assay für die Bestimmung der Inhibitions-Wirkung gegenüber der 3CLpro des sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 wurde erfolgreich etabliert. Durch die zusätzlichen Absorptions , sowie Massenspektren wurden weitere Informationen gewonnen, welche in den oft angewendeten Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer Assays vernachlässigt werden und zu Verfälschungen der Inhibitionsergebnisse führen. Ausgehend von dem literaturbekannten kovalenten Inhibitor 42 wurde ein N1-methyliertes Derivat 43 hergestellt. Durch den Austausch von Benzoesäure durch Ferrocensäure wurden die Analoge 44 und 45 erhalten. Die Restkonzentration des 15mer Substrats nach der Inkubation wurde als Maß der Inhibition herangezogen. Hierfür wurde der molare Extinktionskoeffizient bei 280 nm mit (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 bestimmt. Die Methylierung führte zu einer erhöhten Stabilität. Der Wirkstoffkandidat 45 zeigte außerdem eine vollständige Inhibition im Rahmen des durchgeführten Assays. 4-Hydroxycoumarin wurde verwendet, um die fluoreszenten Analoga 49 und 50 herzustellen. Beide waren instabiler, wobei das Ferrocen-Derivat wie zuvor eine erhöhte Inhibition aufzeigte. Nach der Synthese und Auswertung des Assays für eine Thioester Modellverbindung 53 und einer nachgewiesenen Inaktivierung des etablierten Inhibitors Ebselen wurden die Nebenreaktionen mit DL-Dithiothreitol als Ursache für einen Konzentrationsabfall der aktiven und intakten Inhibitoren und infolgedessen verringerte Inhibition angenommen. Als nächstes wurde bewiesen, dass der Zusatz eines Reduktionsmittels wie keinen Einfluss auf die Enzymaktivität während des kurzen Assays hat. So wurden alle Einflüsse auf die Inhibitionswirkung ausgeschlossen und der nun makellose Assay für Ebselen und den hier vorgestellten neuartigen organometallischen Inhibitor 45 wiederholt, welche beide eine vollständige Inhibition aufwiesen.…