Sebastian Oskar Jarzina

• The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP conceptThe US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP – Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 % or 20_% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 % (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results.…
• Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP)Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP) Konzept als pragmatisches Instrument weithin anerkannt. In dieser Arbeit wurde das AOP Konzept angewandt, um neue Ansätze zur Prüfung auf systemische Toxizität zu unter-suchen. Dazu wurden AOPs für proximale Tubulusschäden, die durch lysosomale Überladung und Inhibition der mtDNA Polymerase- initiiert werden, entwickelt. Diese AOPs wurden als mechanistische Grundlage für die Entwicklung von mechanistisch relevanten in vitro Tests für jedes Schlüsselereignis (KE) verwendet. Um die entwickelten in vitro Tests experimentell zu unterstützen, wurden proximale Tubuluszellen aus der Ratte (NRK-52E) und aus dem Men-schen (RPTEC/TERT1) mit Hilfe von Modellsubstanzen behandelt. Zur Messung der Störung der lysosomalen Funktion im AOP – Rezeptor-vermittelte Endozytose und lysosomale Überla-dung wurden Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid) als Modellsubstanzen verwendet. Die gestörte Expression des lysosomal assoziierten Membran-proteins 1/2 (LAMP 1/2) (KE1) und die Cathepsin D Freisetzung (KE2) wurden mittels Im-munofluoreszenztechnik bestimmt und die Zytotoxizität (KE3) mittels CellTiter-Glo® Zellvia-bilitätstest gemessen. Zwischen den Zelllinien wurden signifikante Unterschiede in der Auf-nahme von Polymyxinen und der Empfindlichkeit beobachtet, was die Bedeutung der in vitro Biokinetik zur Definition eines geeigneten Ausgangspunktes für die Risikobewertung unter-streicht. Im Vergleich zur in vivo Situation, konnte eine eindeutige Expression von relevanten Trans-portern wie Megalin und Cubilin auf mRNA und Proteinebene in den verwendeten Zelllinien (RPTEC/TERT1 und NRK-52E) nicht gezeigt werden, was eine zusätzliche Integration von quantitativen in vitro zu in vivo Extrapolationen (QIVIVE) unabdingbar macht. Die Integrati-on von QIVIVE durch Projektpartner der Universität Utrecht zeigte eine Verbesserung der modellierten biokinetischen Werte für Polymyxin B. Zur Bestimmung des ersten Schlüsseler-eignisse, (KE1) Depletion von mitochondrialer DNA, im AOP – Hemmung der mitochondria-len DNA Polymerase-, wurde nach Behandlung mit Modellsubstanzen (Adefovir, Cidofovir, Tenofovir, Adefovirdipivoxil, Tenofovirdisoproxil Fumarat) eine RT-qPCR Methode verwen-det, um die mtDNA Kopienzahl zu bestimmen. Die mitochondriale Toxizität (KE2) wurde mittels eines hochauflösenden Bildgebungsverfahrens und MitoTracker® vom Projektpartner des Fraunhofer Institut in Hamburg gemessen, während die Zytotoxizität (KE3) mittels Cel-lTiter-Glo® Zellviabilitätstest ermittelt wurde. Entgegen der mechanistischen Hypothese des AOPs – Hemmung der mitochondrialen DNA Polymerase-, führte eine 24 h Behandlung mit den Modellsubstanzen eher zu einer Erhöhung als zu einer Verringerung der mtDNA-Kopienzahl (KE1). Auch wurden nur geringe Auswirkungen auf die mitochondriale Toxizität (KE2) und Zytotoxizität (KE3) beobachtet. Die Behandlung von RPTEC/TERT1 Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine leichte Abnahme der mtDNA Kopienzahl nach Be-handlung mit Adefovirdipivoxil und Tenofovirdisoproxil Fumarat, was den Bedarf an zeit-aufgelösten Daten und Einschränkungen von kurzfristigen in vitro Systemen unterstreicht. Um eine erste Einschätzung für die Risikobewertung basierend auf in vitro Daten zu erhalten, wurden aus den erhaltenen in vitro Daten für jedes KE mögliche Ausgangspunkte (Points of Departure (PoD)) berechnet. Dazu wurden gängige in vitro PoDs berechnet, wie die Effekt-konzentration, bei der 10 % bzw. 20 % Effekt gemessen wurden (EC10, EC20), die höchste Konzentration ohne Wirkung (no observed effect Konzentration (NOEC)), die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (lowest observed effect Konzentration (LOEC)), die Benchmark 10 % (unterer / obere) Konzentrationen (BMC10, BMCL10, BMCU10) und eine modellierte nicht-toxische Konzentration (NtC). Diese wurden dann mit Serum- bzw. Ge-webskonzentrationen aus in vivo Studien verglichen, die nach Gabe therapeutischer / suprathe-rapeutischer Dosen gemessen wurden. Zusätzlich wurde überprüft, ob es mit Hilfe von quanti-tativen Beziehungen zwischen Schlüsselereignissen möglich ist, basierend auf der Bestimmung früher Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorherzusagen. Diese Untersuchungen zeig-ten eine gute Korrelation der aus den mathematischen Beziehungen modellierten Daten mit den tatsächlich gemessenen Werten der Zytotoxizität der Modellsubstanzen Colistin und Po-lymyxin B-Nonapeptid. Im Rahmen der Arbeit wurden auch Unsicherheiten und Limitationen der Strategie deutlich, die maßgebliche Auswirkungen auf die Vorhersage und auf die Risiko-bewertung basierend auf in vitro Resultaten haben.…