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Wirkung der Vaccinia-viral kodierten Proteine Relaxin 1 und Matrixmetalloproteinase 9 auf die extrazelluläre Matrix und die virale Ausbreitung im Tumorgewebe

Effect of the Vaccina virus-encoded proteins relaxin 1 and matrix metalloproteinase 9 on the extracellular matrix and viral spreading within the tumor tissue

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-69592
  • Die heute in der Krebstherapie vorherrschenden konventionellen Therapiemethoden weisen Defizite bezüglich ihrer Wirksamkeit auf und rufen oftmals gravierende Nebenwirkungen hervor. Eine Alternative für die Behandlung von Tumoren ist der Einsatz onkolytischer Viren. Um einen erfolgreichen klinischen Einsatz onkolytischer Viren zu ermöglichen, ist eine Verstärkung von deren Wirksamkeit durch die Insertion therapeutischer Gene wünschenswert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix durch dieDie heute in der Krebstherapie vorherrschenden konventionellen Therapiemethoden weisen Defizite bezüglich ihrer Wirksamkeit auf und rufen oftmals gravierende Nebenwirkungen hervor. Eine Alternative für die Behandlung von Tumoren ist der Einsatz onkolytischer Viren. Um einen erfolgreichen klinischen Einsatz onkolytischer Viren zu ermöglichen, ist eine Verstärkung von deren Wirksamkeit durch die Insertion therapeutischer Gene wünschenswert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix durch die Insertion des Relaxin- oder Matrixmetalloproteinase 9-Gens (MMP-9) in das Vaccinia-Virus Genom erreicht und dadurch die Virusausbreitung im Tumorgewebe erleichtert werden. Hierfür wurden die rekombinanten Vaccinia-Viren GLV-1h169, codierend für das Hormon Relaxin und GLV-1h255, codierend für das Enzym MMP-9, eingesetzt. Es wurde analysiert, ob die Expression dieser Proteine zu einem Abbau von Matrixproteinen führt, dies die Virusausbreitung erleichtert und die Lyse infizierter Tumorzellen gegenüber dem parentalen Virus GLV-1h68 verstärkt. GLV-1h169 wurde in DU145-, PC3- und C33A-Tumor-tragende Mäuse injiziert und die Wirkung des viral-codierten Relaxins auf die extrazelluläre Matrix und die virale Ausbreitung im Tumorgewebe analysiert. In Zellkultur-Experimenten wurde ermittelt, dass die Insertion des Relaxin-Gens in das GLV-1h169-Genom das Replikationsverhalten in DU145-Zellen gegenüber dem des parentalen Virus GLV-1h68 nicht negativ beeinflusst. In DU145-, PC3- und C33A-Tumorschnitten konnte eine Expression von Relaxin in GLV-1h169-infizierten Bereichen nachgewiesen werden. Die Expression von Relaxin soll durch die Aktivierung des Relaxin-Signalweges zur Translation von MMP-9 führen. Das Enzym wird von infizierten Zellen sezerniert und spaltet Proteine der extrazellulären Matrix. Der Gehalt der MMP-9 Substrate Collagen IV und Laminin in GLV-1h169 behandelten DU145- und C33A-Tumoren wurde analysiert und mit jenem in GLV-1h68- und PBS- behandelten Tumoren verglichen. In Virus-behandelten DU145-Tumoren zeigte sich im Vergleich mit PBS-behandelten Tumoren ein signifikant verringerter Collagen IV- und Laminingehalt. Weiterhin war der Collagen IV-Gehalt in GLV-1h169 infizierten Tumoren signifikant niedriger als in GLV-1h68 infizierten. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung des Virustiters und nicht zu einer verbesserten Virusausbreitung. GLV-1h68- und GLV-1h169-infizierte Tumore zeigten gegenüber PBS-behandelten Tumoren eine starke Regression. Die GLV-1h169-vermittelte Relaxin-Expression führte jedoch nicht zu einer weiteren Verstärkung der Tumorregression. In Virus-behandelten C33A-Tumoren wurde eine signifikante Erhöhung des Collagen IV- und Laminingehalts gegenüber PBS-behandelten Tumoren nachgewiesen. Dies könnte durch eine Virus-induzierte Inflammationsreaktion hervorgerufen werden, die eine Fibroblasten-vermittelte Collagenablagerung nach sich zieht. Das MMP-9 Expressionsle-vel war in Virus-behandelten Tumoren gegenüber PBS-behandelten signifikant erhöht, jedoch bewirkte die GLV-1h169-vermittelte Expression von Relaxin keine zusätzliche MMP-9 Expression. In Tumorrandbereichen erfolgte eine Expression von Relaxin und MMP-9, im Tumorinneren jedoch nur eine Expression von Relaxin. Hingegen wurde eine Korrelation zwischen der MMP-9-Expression und der Präsenz MHC II-positiver Zellen beobachtet. Diese Zellen migrieren von außen in das Tumorgewebe und exprimieren dort MMP-9. Bei der Analyse der Virustiter und –ausbreitung im Tumorgewebe zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen GLV-1h68- und GLV-1h169-injizierten Tieren. Die Injektion von beiden onkolytischen Viren in C33A-Tumor-tragende Mäuse führte zu einer starken Tumorregression. Diese wurde jedoch nicht durch die GLV-1h169-vermittelte Relaxin-Expression beeinflusst. Da die Aktivierung des Relaxin-Signalweges zu einer Expression des vascular endothelial growth factors (VEGF) führen kann, welcher die Angiogenese stimuliert, wurde die Blutgefäßdichte in C33A-Tumoren ermittelt. Die Expression von Relaxin führte nicht zu einer erhöhten Blutgefäßdichte. Die Basalmembran von Blutgefäßen enthält Collagen IV, deshalb wurde untersucht, ob die Relaxin-Expression eine erhöhte Permeabilität der Gefäße bewirkt. In den Virus-behandelten Tumoren zeigte sich eine gegenüber PBS-behandelten Tumoren signifikant erhöhte Gefäß-Permeabilität, jedoch bewirkte die Expression von Relaxin keine weitere Erhöhung der Gefäß-Permeabilität...show moreshow less
  • The currently dominating conventional cancer therapy methods are facing limitations regarding their efficacy and often cause severe side effects. An alternative for the treatment of tumors is the use of oncolytic viruses. To ensure a successful clinical application of oncolytic viruses, an enhanced efficacy by the insertion of therapeutic genes is desirable. In the scope of this thesis, a degradation of extracellular matrix proteins should be achieved by the insertion of the relaxin or matrix metalloproteinase 9 gene into the vaccinia virusThe currently dominating conventional cancer therapy methods are facing limitations regarding their efficacy and often cause severe side effects. An alternative for the treatment of tumors is the use of oncolytic viruses. To ensure a successful clinical application of oncolytic viruses, an enhanced efficacy by the insertion of therapeutic genes is desirable. In the scope of this thesis, a degradation of extracellular matrix proteins should be achieved by the insertion of the relaxin or matrix metalloproteinase 9 gene into the vaccinia virus genome, facilitating increased viral spreading in the tumor tissue. To this end, the recombinant vaccinia viruses GLV-1h169, encoding the hormone relaxin and GLV-1h255, encoding the enzyme MMP-9 were used. It was analyzed whether the expression of these proteins causes a degradation of matrix proteins and leads to an increased viral spreading and an enhanced lysis of infected tumor cells, when compared to the parental virus GLV-1h68. DU145, PC3 and C33A tumor-bearing mice, respectively, were injected with GLV-1h169 and the effect of virus-encoded relaxin on the extracellular matrix and viral spreading inside the tumor mass was analyzed. Tissue culture experiments confirmed that the inser-tion of the relaxin gene into the GLV-1h169 genome does not negatively influence the virus replication in DU145 cells when compared to that of the parental virus GLV-1h68. An expression of relaxin in GLV-1h169-infected tumor areas in DU145, PC3 and C33A tumor sections was shown. The expression of relaxin should activate the relaxin pathway, inducing the translation of MMP-9. The enzyme is secreted by infected cells and cleaves proteins of the extracellular matrix. The content of the MMP-9 substrates collagen IV and laminin in GLV-1h169-treated DU145 and C33A tumors was analyzed and compared to that of GLV-1h68- and PBS-treated tumors. Virus-treated tumors showed a significantly lower collagen IV and laminin content than those treated with PBS. Furthermore, the collagen IV content in GLV-1h169-treated tumors was significantly lower than in those treated with GLV-1h68. This did not lead to higher virus titers or to an enhanced virus spreading. Compared to PBS-treated tumors, those infected with GLV-1h68 or GLV-1h169 regressed significantly. The GLV-1h169-mediated relaxin expression did not further enhance tumor regression. Virus-treated C33A tumors showed a significantly increased collagen IV and laminin con-tent compared to those treated with PBS. This could be due to a virus-induced inflamma-tion, leading to a fibroblast-mediated collagen deposition. The MMP-9 expression level in virus-treated tumors was significantly higher than in those treated with PBS. However, the GLV-1h169-mediated expression of relaxin did not further increase MMP-9 expression. In outer tumor areas relaxin and MMP-9 were expressed, in inner tumor areas only relaxin was expressed. In contrast, a correlation between the expression of MMP-9 and the presence of MHC II-positive cells was observed. These cells migrate from the outside into the tumor tissue where they express MMP-9. The analysis of virus titers and spreading inside the tumor mass revealed no significant differences between GLV-1h68- and GLV-1h169-injected mice. The injection of both oncolytic viruses led to a pronounced tumor regression, which was not further enhanced by the GLV-1h169-mediated expression of relaxin...show moreshow less

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Metadaten
Author: Simon Schäfer
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-69592
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Biologie
Faculties:Fakultät für Chemie und Pharmazie / Lehrstuhl für Biochemie
Date of final exam:2012/02/29
Language:German
Year of Completion:2012
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
GND Keyword:Relaxin; Vaccinia-Virus; Prostatakrebs
Tag:Cervix-Karzinom; MMP-9; onkolytische Virustherapie
Cervix carcinoma; MMP-9; oncolytic virotherapy
Release Date:2013/05/24
Advisor:Prof, Dr. A. A. Szalay
Licence (German):License LogoCC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitung