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Klonierung und Charakterisierung der humanen Puromycin-sensitiven Aminopeptidase

Cloning and characterization of the human Puromycin-sensitive aminopeptidase

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-11135
  • Auf der Suche nach neuen Vitamin D-responsiven Genen wurde die Methodik des Differential Display verwendet. Die eingesetzten Oligonukleotid-Primer waren homolog zur 24-Hydroxylase, einem für den Vitamin D-Stoffwechsel wichtigen Enzym, das von Vitamin D selbst reguliert wird. Mit diesem Ansatz sollten neue Mitglieder aus der Familie der P450-Enzyme gefunden werden. Mehrere differentiell exprimierte DNA-Fragmente wurden in der Folge isoliert und aufgearbeitet, die Sequenzierung eines 550 bp großen Fragments ergab beim Datenbankabgleich keineAuf der Suche nach neuen Vitamin D-responsiven Genen wurde die Methodik des Differential Display verwendet. Die eingesetzten Oligonukleotid-Primer waren homolog zur 24-Hydroxylase, einem für den Vitamin D-Stoffwechsel wichtigen Enzym, das von Vitamin D selbst reguliert wird. Mit diesem Ansatz sollten neue Mitglieder aus der Familie der P450-Enzyme gefunden werden. Mehrere differentiell exprimierte DNA-Fragmente wurden in der Folge isoliert und aufgearbeitet, die Sequenzierung eines 550 bp großen Fragments ergab beim Datenbankabgleich keine signifikanten Homologien und ließ daher auf ein noch unbekanntes Gen schließen. Die Klonierung und weitere Charakterisierung dieses Gens wies letztlich in eine nicht erwartete Richtung. Mit der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase war ein Gen aus der Familie der Metallopeptidasen gefunden worden, eine Exopeptidase mit einem Zink-Ion im katalytischen Zentrum. Proteinchemisch schon vor einigen Jahren isoliert, war über die PSA (Puromycin-sensitive Aminopeptidase) bekannt, daß sie N-terminale Aminosäuren hydrolysiert mit einer Spezifität für basisch / neutrales und hydrophobes Substrat und überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist. Namengebend ist die starke Hemmbarkeit der Enzymaktivität durch Puromycin. Vorstehendes summiert die wichtigsten biochemischen Eigenschaften des Enzyms, aus molekularbiologischer Sicht war zum Zeitpunkt der Aufnahme der Arbeiten jedoch noch wenig über die PSA bekannt. Dies hat sich in letzter Zeit geändert, während der Sequenzierarbeiten im Rahmen dieser Arbeit konnte eine schweizer Arbeitsgruppe die Klonierung und Sequenz-Charakterisierung der murinen und später humanen cDNA des Gens veröffentlichen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe wie auch den im Zuge der vorliegenden Dissertation erarbeiteten Resultaten konnte das molekularbiologische Wissen um die PSA erheblich erweitert werden. So liegt mittlerweile die komplette Nukleotid- und Aminosäurensequenz des Gens vor, das Auffinden des Zink-Bindungsmotives HEXXH(X)18E erlaubte die Einordnung des Enzyms in die Familie M1 der Metallopeptidasen, weiterhin konnte das Gen auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert werden. Weitere Daten zur Gewebe- und Zellinienexpression sind nun ebenfalls vorhanden, interessant hierbei neben der erwartet starken Expression im Gehirn das deutliche Vorhandensein in Hoden und Nebennierenrinde. Auch in Bezug auf die Regulation der PSA wurden neue Ergebnisse erzielt, wichtigstes Resultat im Rahmen dieser Arbeit ist hier, daß sich die früher festgestellte Vitamin D –Responsivität nicht bestätigen ließ. Für die Zukunft von außerordentlichem Interesse dürfte das kürzlich gelungene Erstellen PSA-defizienter Mäuse sein, das nun erste Beobachtungen von Auswirkungen der Gen-Deletion am lebenden Organismus erlaubt. Trotz alledem sind in Bezug auf die physiologische Rolle der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase weiterhin viele Fragen ungeklärt. Wie hoffentlich in dieser Dissertation herausgearbeitet, ergeben sich dabei interessante Perspektiven für die mögliche Funktion des Enzyms im Organismus.show moreshow less
  • Searching for new vitamin D responsive genes we employed the differential display-technique. Oligonucleotide-primers used were homologous to the 24-hydroxylase, an enzyme important in vitamin D metabolism and itself regulated by vitamin D. With the above we were hoping to isolate new members of the p450 enzyme family. Several DNA fragments showed differential expression and were subsequently isolated and analysed. Comparing the sequence of one 550 bp fragment with published Genbank sequences resulted in no significant homologies indicating theSearching for new vitamin D responsive genes we employed the differential display-technique. Oligonucleotide-primers used were homologous to the 24-hydroxylase, an enzyme important in vitamin D metabolism and itself regulated by vitamin D. With the above we were hoping to isolate new members of the p450 enzyme family. Several DNA fragments showed differential expression and were subsequently isolated and analysed. Comparing the sequence of one 550 bp fragment with published Genbank sequences resulted in no significant homologies indicating the possibility of an unknown gene. Cloning and characterization of this gene did lead in an unexpected direction. We had found the Puromycin-sensitive aminopeptidase, a member of the family of metallopeptidases and an exopeptidase with a zinc-ion in the catalytical centre. The protein chemistry of this enzyme had been known for several years. The PSA (Puromycin-sensitive aminopeptidase) was known to hydrolyse N-terminal amino acids with specificity for alkaline/neutral as well as hydrophobic substrate. Localized predominantly in the cytoplasm the activity of the enzyme is inhibited by Puromycin. The above summarizes the protein chemistry of the PSA, however, little was known in the beginning about the molecular biology of the gene. This has changed as of late, a Swiss team has recently published the cloning and sequencing of the murine and later the human gene. These published results and data gathered within the scope of this thesis helped to widen our knowledge of the molecular biology of the PSA. The DNA- as well as the amino acid sequence of the gene is now established, since the protein contains the zinc-binding motif HEXXH(X)18E it could be identified as a member of family M1 of metallopeptidases. Furthermore its chromosomal localization could be identified at 17q21. There are also more data about expression in tissues as well as cell lines with the most interesting being the strong expression in testes and adrenal cortex. Regarding the regulation of the gene more results were gathered, the previously found regulation by vitamin D could not be confirmed. The construction of PSA-deficient mice, which has been accomplished recently, promises insight into the consequences of gene-deletion in the living organism. However, in terms of the physiologic role of the Puromycin-sensitive Aminopeptidase, many interesting questions remain unanswered.show moreshow less

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Metadaten
Author: Wolfgang Bauer
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-11135
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Medizinische Fakultät / Lehrstuhl für Orthopädie
Date of final exam:2004/11/12
Language:German
Year of Completion:2002
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Tag:Aminopeptidase; Klonierung; Molekularbiologie; Puromycin
Puromycin; aminopeptidase; cloning; molecular biology
Release Date:2004/12/22
Advisor:Prof. Franz Jakob