Romina Vardapour

• Wilms tumor (WT) or nephroblastoma is the most common kidney tumor in childhood. Several genetic alterations have been identified in WT over the past years. However, a clear-cut underlying genetic defect has remained elusive. Growing evidence suggests that miRNA processing genes play a major role in the formation of pediatric tumors, including WT. We and others have identified the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 as key players in Wilms tumorigenesis. Exome sequence analysis of a cohort of blastemal-type WTs revealed the recurrent hotspotWilms tumor (WT) or nephroblastoma is the most common kidney tumor in childhood. Several genetic alterations have been identified in WT over the past years. However, a clear-cut underlying genetic defect has remained elusive. Growing evidence suggests that miRNA processing genes play a major role in the formation of pediatric tumors, including WT. We and others have identified the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 as key players in Wilms tumorigenesis. Exome sequence analysis of a cohort of blastemal-type WTs revealed the recurrent hotspot mutations DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mapping to regions important for catalyic activity and RNA-binding. These alterations were expected to affect processing of miRNA precursors, ultimately leading to altered miRNA expression. Indeed, mutated tumor samples were characterized by distinct miRNA patterns. Notably, these mutations have been observed almost exclusively in WT, suggesting that they play a specific role in WT formation. The aim of the present work was to first examine the mutation frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K in a larger cohort of WTs, and to further characterize these microprocessor gene mutations as potential oncogenic drivers for WT formation. Screening of additional 700 WT samples by allele-specific PCR revealed a high frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mutations, with the highest incidence found in tumors of high-risk histology. DROSHA E1147K was heterozygously expressed in all cases, which strongly implies a dominant negative effect. In contrast, DGCR8 E518K exclusively exhibited homozygous expression, suggestive for the mutation to act recessive. To functionally assess the mutations of the microprocessor complex in vitro, I generated stable HEK293T cell lines with inducible overexpression of DROSHA E1147K, and stable mouse embryonic stem cell (mESC) lines with inducible overexpression of DGCR8 E518K. To mimic the homozygous expression observed in WT, DGCR8 mESC lines were generated on a DGCR8 knockout background. Inducible overexpression of wild-type or mutant DROSHA in HEK293T cells showed that DROSHA E1147K leads to a global downregulation of miRNA expression. It has previously been shown that the knockout of DGCR8 in mESCs also results in a significant downregulation of canonical miRNAs. Inducible overexpression of wild type DGCR8 rescued this processing defect. DGCR8 E518K on the other hand, only led to a partial rescue. Differentially expressed miRNAs comprised members of the ESC cell cycle (ESCC) and let-7 miRNA families whose antagonism is known to play a pivotal role in the regulation of stem cell properties. Along with altered miRNA expression, DGCR8-E518K mESCs exhibited alterations in target gene expression potentially affecting various biological processes. We could observe decreased proliferation rates, most likely due to reduced cell viability. DGCR8-E518K seemed to be able to overcome the block of G1-S transition and to rescue the cell cycle defect in DGCR8-KO mESCs, albeit not to the full extent like DGCR8-wild-type. Moreover, DGCR8-E518K appeared to be unable to completely block epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Embryoid bodies (EBs) with the E518K mutation, however, were still able to silence the self-renewal program rescuing the differentiation defect in DGCR8-KO mESCs. Taken together, I could show that DROSHA E1147K and DGCR8 E518K are frequent events in WT with the highest incidence in high-risk tumor entities. Either mutation led to altered miRNA expression in vitro confirming our previous findings in tumor samples. While the DROSHA E1147K mutation resulted in a global downregulation of canonical miRNAs, DGCR8 E518K was able to retain significant activity of the microprocessor complex, suggesting that partial reduction of activity or altered specificity may be critical in Wilms tumorigenesis. Despite the significant differences found in the miRNA and mRNA profiles of DGCR8 E518K and DGCR8-wild-type mESCs, functional analysis showed that DGCR8 E518K could mostly restore important cellular functions in the knockout and only slightly differed from the wild-type situation. Further studies in a rather physiological environment, such as in a WT blastemal model system, may additionally help to better assess the subtle differences between DGCR8 E518K and DGCR8 wild-type observed in our mESC lines. Together with our findings, these model systems may thus contribute to better understand the role of these microprocessor mutations in the formation of WT.…
• Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist der häufigste Nierentumor im Kindesalter. In den letzten Jahren wurden bereits mehrere genetische Veränderungen in Wilms Tumoren festgestellt. Bisher konnte jedoch keine eindeutige genetische Ursache gefunden werden. Immer mehr Erkenntnisse deuten darauf hin, dass miRNA Prozessierungsgene eine wichtige Rolle bei der Entstehung von pädiatrischen Tumoren, einschließlich von WT, spielen. Uns ist es gelungen die Mikroprozessor-Gene DROSHA und DGCR8 als entscheidende Faktoren in derDer Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist der häufigste Nierentumor im Kindesalter. In den letzten Jahren wurden bereits mehrere genetische Veränderungen in Wilms Tumoren festgestellt. Bisher konnte jedoch keine eindeutige genetische Ursache gefunden werden. Immer mehr Erkenntnisse deuten darauf hin, dass miRNA Prozessierungsgene eine wichtige Rolle bei der Entstehung von pädiatrischen Tumoren, einschließlich von WT, spielen. Uns ist es gelungen die Mikroprozessor-Gene DROSHA und DGCR8 als entscheidende Faktoren in der WT-Entstehung zu identifizieren. Mit Hilfe der Exom-Sequenzierung einer Kohorte blastemreicher Wilms Tumoren konnten die wiederkehrenden Hotspot-Mutationen DROSHA E1147K and DGCR8 E518K gefunden werden. Diese Mutationen betreffen Regionen, die für die katalytische Aktivität und die Bindung von RNA wichtig sind. Diese Veränderungen beeinflussen vermutlich die Prozessierung von Vorläufer-miRNAs und führen letztendlich zu einer veränderten miRNA Expression. In der Tat waren mutierte Tumorproben durch auffällige Expressionsmuster gekennzeichnet. Bemerkenswerterweise wurden diese Mutationen fast ausschließlich in WT beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie eine spezifische Rolle bei der Entstehung von WT spielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zunächst die Mutationshäufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K in einer größeren Kohorte von Wilms Tumoren zu untersuchen und anschließend diese Mikroprozessor-Genmutationen als mögliche onkogene Treiber für die WT-Entstehung näher zu charakterisieren. Das Screening von zusätzlichen 700 WT-Proben mittels allelspezifischer PCR ergab eine hohe Häufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K Mutationen. Dabei traten sie vermehrt bei Tumoren mit einer Hochrisikohistologie auf. Die DROSHA E1147K Mutation wurde in allen Fällen heterozygot exprimiert, was einen dominant-negativen Effekt impliziert. Im Gegensatz dazu zeigte die DGCR8 E518K Mutation ausschließlich eine homozygote Expression, was darauf hindeutet, dass die Mutation rezessiv wirkt. Um die Mutationen des Mikroprozessorkomplexes in vitro funktionell zu untersuchen, generierte ich stabile HEK293T-Zelllinien mit induzierbarer Überexpression von DROSHA E1147K, und stabile embryonale Mausstammzelllinien mit induzierbarer Überexpression von DGCR8 E518K. Um die in WT beobachtete homozygote Expression nachzustellen, wurden für die Erzeugung der DGCR8-Zelllinien Mausstammzellen mit einem DGCR8-Knockout verwendet. Die induzierbare Überexpression von Wildtyp oder mutiertem DROSHA in HEK293T-Zellen zeigte, dass DROSHA E1147K zu einer globalen Herunterregulierung der miRNA-Expression führt. Es wurde zuvor gezeigt, dass der Knockout von DGCR8 in Mausstammzellen ebenfalls zu einer signifikanten Herunterregulierung kanonischer miRNAs führt. Die induzierbare Überexpression von Wildtyp DGCR8 konnte diesen Prozessierungsdefekt aufheben. DGCR8 E518K führte dagegen nur zu einer partiellen Behebung des Prozessierungsdefekts. Differenziell exprimierte miRNAs umfassten hierbei Mitglieder aus der stammzellspezifischen ESCC-Familie und der let-7-miRNA-Familie, deren Antagonismus bekanntermaßen eine bedeutende Rolle bei der Regulation von Stammzelleigenschaften spielt. Zusammen mit einer veränderten miRNA-Expression zeigten DGCR8-E518K-Zellen Veränderungen in der Zielgenexpression, welche möglicherweise verschiedene biologische Prozesse beeinflussen können. Wir konnten verringerte Proliferationsraten beobachten, höchstwahrscheinlich aufgrund einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. DGCR8-E518K schien in der Lage zu sein, den Block des G1-S Übergangs zu überwinden und den Zellzyklusdefekt in DGCR8-KO-Zellen zu beheben, wenn auch nicht in vollem Umfang wie Wildtyp DGCR8. Darüber hinaus schien DGCR8-E518K nicht in der Lage zu sein, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) vollständig blockieren zu können. Embryoid-Körper (EBs) mit der E518K Mutation konnten das Selbsterneuerungsprogramm jedoch noch unterdrücken und somit den Differenzierungsdefekt in DGCR8-KO-Zellen beheben. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass DROSHA E1147K und DGCR8 E518K häufige Mutationen in WT sind und dabei am häufigsten in Hochrisiko-Tumoren vorkommen. Jede dieser Mutationen führte in vitro zu einer veränderten miRNA-Expression, was unsere vorherigen Befunde in Tumorproben bestätigte. Während die DROSHA E1147K Mutation zu einer globalen Herunterregulierung kanonischer miRNAs führte, konnte die DGCR8 E518K Mutation die Aktivität des Mikroprozessorkomplexes größtenteils wiederherstellen, was darauf hindeutet, dass eine teilweise Verringerung der Aktivität oder eine veränderte Spezifität bei der WT-Entstehung kritisch sein könnte. Trotz der signifikanten Unterschiede in den miRNA- und mRNA-Profilen von DGCR8-E518K- und DGCR8 Wildtyp-Zellen, ergab die Funktionsanalyse, dass DGCR8 E518K viele wichtige Zellfunktionen im Knockout wiederherstellen konnte und sich nur geringfügig von der Wildtyp-Situation unterschied. Weitere Studien unter physiologischeren Bedingungen, wie beispielsweise in einem WT-Blastem-Modellsystem, könnten zusätzlich helfen, die in unseren Mausstammzelllinien beobachteten feinen Unterschiede zwischen DGCR8 E518K und DGCR8 Wildtyp besser bewerten zu können. Zusammen mit unseren Erkenntnissen könnten diese Modellsysteme somit dazu beitragen, die Rolle dieser Mikroprozessormutationen bei der WT-Entstehung besser zu verstehen.…