Markus Slopianka

• Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. DesDie Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können. Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht. Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische Zusammenfassung Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten. Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an. Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten. Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten. In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der Zusammenfassung pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern.…
• Drug-induced liver injury (DILI) remains a significant challenge in preclinical drug development. Nonclinical studies provide an opportunity to correlate the biochemical and morphological findings; however, liver injury is often complex and heterogeneous, confounding the ability to relate biochemical changes to specific, histopathological patterns of liver injury. The diagnostic performance of the available hepatobiliary markers, such as alanine aminotransferase (ALAT), aspartate aminotransferase (ASAT) or alkaline phosphatase (APh), forDrug-induced liver injury (DILI) remains a significant challenge in preclinical drug development. Nonclinical studies provide an opportunity to correlate the biochemical and morphological findings; however, liver injury is often complex and heterogeneous, confounding the ability to relate biochemical changes to specific, histopathological patterns of liver injury. The diagnostic performance of the available hepatobiliary markers, such as alanine aminotransferase (ALAT), aspartate aminotransferase (ASAT) or alkaline phosphatase (APh), for specific manifestations of liver injury, is often limited and insensitive, e.g. minimal to slight liver pathology might not result in changes to the serum marker. Furthermore, histopathological findings in the liver can occur without there being significant changes in the serum markers and vice versa. Although histopathology is the gold standard, its invasive nature makes it unsuitable for monitoring liver injury in toxicological and non-clinical studies. In recent years, study results of bile acid profiling, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), indicated diagnostic potential regarding the detection of hepatotoxicity. This work aims to establish bile acid profiling in preclinical drug development and to demonstrate that bile acids can provide a valuable contribution to characterizing liver injury in preclinical safety diagnostics. For this purpose, a quantitative LC-MS/MS method was established and validated, in order to analyze 20 different endogenous bile acids in rats. The quantitative analysis enabled the selective determination of primary, conjugated and secondary bile acids. 2 MRM-transitions for qualitative and quantitative analysis were used for the quantification of the individual bile acids. Twenty bile acid reference standards were used for the calibration range. A seven-point calibration, in ascending concentration, was performed to quantify the absolute endogenous bile acid concentrations. Ten isotopically labeled internal standards were employed in the analyses to compensate for matrix effects. The reproducibility of the current measurements was monitored by quality controls (QCs) inserted into three different concentration ranges. Bile acid profiling was performed by LC-MS/MS of plasma and liver tissue of rats that had been treated with different hepatotoxins. The results of the bile acid profiling and histopathological evaluation revealed correlation between bile acid profiles and histopathological graded liver toxicity, e.g., the quantitative analysis and histopathological examination showed that macrovesicular steatosis was induced in the livers of male rats which had been treated with amitriptyline for 14 days. Classic serum markers, such as ALAT, ASAT, and gamma-glutamyltransferase (γGT), were unable to detect this specific manifestation of liver injury. In contrast, the concentrations of glycine-conjugated bile acids Summary increased while there was a parallel decrease in the levels of taurine-conjugated bile acids in the treated rats’ liver tissue. At the same time, there was a significant increase in the concentration of primary bile acids, CA and CDCA, in plasma of treated rats. Different bile acid profiles were observed following methapyrilene-induced liver cell necrosis with hepatobiliary damage. After a 14-day treatment phase with 80 mg/kg body weight methapyrilene, the concentrations of 11 bile acids increased in liver tissue of treated animals. At the same time, the levels of all 20 individual bile acids increased in plasma of treated rats. In addition to the quantitative analysis of bile acids with LC-MS/MS, the expression of specific genes associated with bile acid biosynthesis, and the transport and regulation of bile acid homeostasis, was analyzed using multiplex analysis of targeted mRNA. The increased expression of efflux transporter genes belonging to the multidrug resistance-related protein (MRP) family, indicated an increase in the efflux transport of bile acids into blood, and corresponded to increased bile acid concentrations in the plasma of treated rats. Furthermore, bile acid profiles originated from the animal studies, were used as reference to evaluate bile acid profiles regarding liver toxicity on a liver cell-based biological system. In vitro experiments were performed using primary rat hepatocytes between two collagen matrices (sandwich cultivation). This traditional in vitro model is used to study of hepatobiliary transport alterations (e.g., Bile Salt Export Pump, BSEP). Bile acid profiling of the cell culture supernatants demonstrated that the primary hepatocytes produced conjugated bile acids. Incubation with primary bile acids resulted in an improvement of the in vitro system by producing conjugated bile acids, in addition to those already existed. Exposure to troglitazone and methapyrilene resulted in changes in the hepatocytes’ bile acid homeostasis. In the in vivo experiments, methapyrilene treatment induced necrosis and hepatobiliary damage in the treated rats. There was a substantial increase in the concentration of plasma bile acids in the methapyrilene treatment group (including GCA and TCA), which correlated with the histopathological findings. Based on these data and the pharmacokinetic properties of methapyrilene, a study design was developed that used rat hepatocytes in sandwich cultures to provide an initial estimate of bile acid concentration changes in the in vitro test system. There was an increase in GCA and TCA concentrations in the cell culture medium from day 8 of the methapyrilene treatment. Therefore, the in vitro test system may have the potential to support or even reduce animal studies for evaluating hepatotoxicity. Bile acid profiling in male and female rats is a suitable method for detecting and differentiating liver injury. The technology can be used flexibly and can support already established test procedures, such as the determination of serum markers in clinical chemistry and histopathology. Summary Thus, bile acid profiling has the potential to fill the gap in the detection and characterization of hepatotoxicity, as part of the evaluation of preclinical drug candidates.…