Kathrin Becker

• Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen. Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eineTumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen. Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein. Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen. Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen. Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten. Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden. Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern.…
• Tumor stem cells seem to be the engine for initiation and progression of breast cancer. By their potential for unlimited proliferation, dissemination and relapse they largely determine the prognosis and mortality of breast cancer patients. This thesis shows mechanisms breast cancer (stem) cells use to escape from an immune response by NK cells. Using flow cytometry analysis, we defined a subpopulation of CD44highCD24low cells corresponding to the tumor stem cell fraction of MCF-7 breast cancer cells. Compared to the native MCF-7 cellTumor stem cells seem to be the engine for initiation and progression of breast cancer. By their potential for unlimited proliferation, dissemination and relapse they largely determine the prognosis and mortality of breast cancer patients. This thesis shows mechanisms breast cancer (stem) cells use to escape from an immune response by NK cells. Using flow cytometry analysis, we defined a subpopulation of CD44highCD24low cells corresponding to the tumor stem cell fraction of MCF-7 breast cancer cells. Compared to the native MCF-7 cell population we observed an enrichment of tumor stem cells in vitro after co-culture with activated NK cells from healthy human donors. Incubation of breast cancer cells with NK cell supernatant resulted in no significant change, which implies that the observed NK cell-mediated enrichment of the cancer stem cell population depends on direct cell-cell contact. One possibility is that these tumor stem cells could be enriched by selection, i.e. by preferential killing of their more differentiated counterparts. Alternatively, they could arise de novo via epithelial to mesenchymal transition (EMT). A selection process was supported by data showing reduced surface expression of NK cell ligands on tumor stem cells compared to non-stem cells. The investigated breast cancer cell lines (MCF-7, SKBR 3, BT 474 and MDA MB 231) showed a distinctly regulated pattern of activating NKG2D-ligands (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3) and DNAM 1-ligands (CD112, CD155) and of MHC1-molecules on tumor stem cells and non-stem cells. The comparatively lower expression of NK cell ligands suggests a reduced vulnerability of tumor stem cells towards NK cells. However, we also showed the induction of tumor stem cells from differentiated epithelial tumor cells via EMT. Tumor cells with the phenotype CD44highCD24low arose de novo from a stem cell depleted MCF-7 tumor cell population which was then co-incubated with NK cells. Downregulation of the epithelial cell adhesion molecule E-cadherin as well as upregulation of mesenchymal markers such as the structural protein vimentin, the EMT-inducing transcription factors Slug, Snail and Twist and the stem cell-typical transcription factors Oct4, KLF4 and cMyc on mRNA level indicate an EMT-triggered induction of tumor stem cells after co-culture of MCF-7 with NK cells. We also found that the direct contact between tumor cells and non-lytic NK cells is of vital importance for the induction of tumor stem cells. These cell-cell interactions appeared to depend on NKG2D and DNAM-1 and to include a consecutive stem cell induction via EMT. As the proportion of tumor stem cells after co-culture of native MCF-7 cells and NK cells was almost twice the number of stem cells arisen from an equally treated stem cell depleted fraction we can assume that an above-average survival of tumor stem cells due to selection stress can also contribute to immune escape. Regarding their clonogenicity we noticed no difference between pre-existent and induced tumor stem cells. Both fractions possessed the ability to generate new colonies of similar quantity. Thus, we showed that upon exposure to NK cells EMT-triggered induction considerably contributes to the enrichment of breast cancer stem cells. An additional process of stem cell selection seems to be realistic. Interactions of the NK cell receptors NKG2D and DNAM 1 and its ligands on tumor cells respectively seem to play a key role. The recognition that de-differentiation may represent a previously unrecognized immune escape mechanism of breast cancer cells could serve as a starting point for medical interventions, with the aim of preventing stem cell accumulation in breast cancer and thus improving the prognosis of breast cancer patients.…