Julia Andrea Ertl

• Enzym-Modifikationen finden in der Natur in Form von posttranslationalen Protein-Modifikationen statt und sind ein faszinierender Mechanismus, um die biologische Vielfalt und Funktion von Proteinen um ein Vielfaches zu erhöhen. Daher ist es für ein ganzheitliches Verständnis bestimmter biologischer Prozesse oder enzymatischer Struktur-Funktions-Beziehungen unerlässlich, chemische Methoden zu entwickeln, die in der Lage sind, diese natürliche Diversität nachzuahmen.[61] Die wohl größte Herausforderung der chemischen Protein-Konjugation ist dieEnzym-Modifikationen finden in der Natur in Form von posttranslationalen Protein-Modifikationen statt und sind ein faszinierender Mechanismus, um die biologische Vielfalt und Funktion von Proteinen um ein Vielfaches zu erhöhen. Daher ist es für ein ganzheitliches Verständnis bestimmter biologischer Prozesse oder enzymatischer Struktur-Funktions-Beziehungen unerlässlich, chemische Methoden zu entwickeln, die in der Lage sind, diese natürliche Diversität nachzuahmen.[61] Die wohl größte Herausforderung der chemischen Protein-Konjugation ist die chemo- und regioselektive Modifikation einer gezielten Aminosäure bei gleichzeitig milden und physiologischen Reaktionsbedingungen. Trotz zahlreich beschriebener Ansätze zur selektiven Protein-Modifikation, bedarf es weiterhin neuer Methoden, da viele bestehende Herangehens¬weisen auf ein spezielles System zugeschnitten sind.[9, 63] Aus diesem Grund sollte im Rahmen dieser Arbeit eine breit anwendbare Methode zur selektiven chemischen Tyrosin-Modifikation am Modell der Levansucrase aus Bacillus megaterium entwickelt werden. Durch eine zweistufige Protein-Modifikation, bestehend aus einer En-Reaktion im ersten Schritt und einer Click-Reaktion im zweiten Konjugationsschritt, gelang es die Produktspezifität der Bm Levansucrase rational zu beeinflussen. Zunächst wurde die Tyrosin-spezifische En-Reaktion mit der Luminol-Verbindung 1 an natürlich vorkommenden Tyrosin-Seitenketten der Levansucrase erprobt und analysiert. Hierbei zeigte sich durch massenspektrometrische Untersuchungen, dass hauptsächlich zwei der 25 vorhandenen Tyrosin-Reste mit dem Luminol-Tag 1 modifiziert wurden, zu denen die Seitenketten Y247 und Y196 gehörten. Um die Auswirkungen der Tyrosin-Modifikation leichter interpretieren zu können und eine gegenseitige Beeinflussung auszuschließen, wurde vorerst mit der Einzelmutante Y247F gearbeitet. Da nach der ersten Modifikation der Variante Y247F geringe Veränderungen im Produkt¬spektrum beobachtet wurden, insbesondere im hoch-molekularen Bereich, wurde die Click-Reaktion im zweiten Schritt mit der Intention durchgeführt, diesen Effekt zu verstärken. Schließlich bewirkte die Click-Reaktion mit Azidoglucose (AzGlc) bei Variante Y247F-1-AzGlc eine erhebliche Verschiebung der Produktverteilung von kleinen Fructooligosacchariden (ca. 1100 Da) hin zu hoch-molekularem Levan (ca. 2,1∙106 Da). Drei weitere Positionen, die in der dritten Zone des Enzyms liegen, wurden für die gentechnische Substitution gegen nicht-native Tyrosin-Reste ausgewählt. Dadurch wurden die Varianten E314Y, D248Y sowie F445Y erhalten und anschließend wie zuvor in zwei Schritten chemisch modifiziert. Die Modifikation dieser Varianten führte hinsichtlich der Veränderung des Produktprofils zu ähnlichen Ergebnissen, wie sie mit dem Enzym Y247F erhalten wurden (Übersicht 1, A). Um den Einfluss verschiedener Seitenketten zu analysieren, wurden neben der Azidoglucose vier weitere Azido-Verbindungen in der Click-Reaktion getestet. Die Resultate aus den genannten Untersuchungen und die Einbeziehung molekular¬-dynamischer Simulationen ließen erste Rückschlüsse auf die mechanistischen Prozesse der Bm Levansucrase und deren gezielte Manipulation zu: Die Größe der eingeführten Seitenkette sowie die Fähigkeit des Tags polare Wechselwirkungen auszubilden, spielen eine entscheidende Rolle zur rationalen Modulation der Produkt¬spezifität. Insbesondere die räumliche Orientierung und Bewegung der Seitenkette 1 AzGlc und die damit einhergehende sterische Hinderung trugen dazu bei, eine vorzeitige Dissoziation der wachsenden Fructane zu verhindern und ermöglichten dadurch die prozessive Polymersynthese. Weitere Erkenntnisse über den Levan-Elongationsmechanismus wurden durch die Modifikation der Varianten N126Y und S125Y erhalten. Diese lagen im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Tyrosin-Resten nicht im Wachstumsverlauf des Substrats und besaßen zudem eine kürzere Distanz zum aktiven Zentrum. In beiden Fällen führte bereits die erste Modifikation mit Luminol-Derivat 1 zu völlig unter¬schiedlichen Produktprofilen im Vergleich zu den zuvor untersuchten Enzym-Varianten. Während mit der Variante N126Y-1 eine signifikante Akkumulation (bis zu 800 % Zunahme) verschiedener Oligosaccharide erzielt wurde, synthetisierte die Variante S125Y-1 schon nach dem ersten Modifikationsschritt Levan-Polymer (Übersicht 1, B/C). Die zugrunde-liegenden Interaktionen und Trajektorien der eingeführten Seitenkette wurden ebenfalls mit Hilfe von MD Simulationen analysiert und bestätigten die zuvor getroffenen Annahmen. Durch die räumliche Nähe zur Substrat-Bindungstasche reichte bei Variante S125Y 1 bereits die Luminol-Verbindung aus, um die Substrat-Dissoziation zu verhindern und damit die Polymer¬synthese zu induzieren. Hingegen dazu ergaben die Simulationen eine sehr dynamische und fluktuierende Seitenkette für N126Y-1, was vermutlich zur Destabilisierung initialer Wechselwirkungen zwischen Substrat und der Protein¬oberfläche führte und dadurch die Freisetzung und Akkumulation kurzer Oligo-saccharide begünstigte. Durch die bioorthogonale chemische Einführung einer artifiziellen Seitenkette war es schließlich möglich, das Produktspektrum der Bm Levansucrase sowohl in Richtung Polymersynthese als auch in Richtung kurzer Oligosaccharide zu lenken. Unter Verwendung der Tyrosin-spezifischen En-Reaktion wurden dafür gezielt native und nicht-native Tyrosin-Reste selektiv modifiziert und in einer Folge¬reaktion mittels Click-Chemie zusätzlich derivatisiert. Die Auswirkungen der Modifikations-Reaktionen auf den Elongationsmechanismus des Substrats konnten durch MD-Simulationen aufgeklärt werden. Das Ziel, die Produktspezifität der Levansucrase rational zu beeinflussen und in eine gezielte Richtung zu steuern, wurde damit erfolgreich umgesetzt. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag darin, eine effiziente und einfache Methode zur Reinigung eines Fructan-Gemisches zu entwickeln, um damit den Zugang zu Oligo-sacchariden definierter Größen zu vereinfachen. Die Verfügbarkeit bestimmter Oligosaccharide in ausreichender Menge und Reinheit würde die Untersuchung von Fructanen auf ihre präbiotischen Eigenschaften erleichtern und zum Verständnis der Korrelation zwischen dem Darmmikrobiom und verschiedenen Krankheits¬bildern beitragen.[125] Mit Hilfe der Levansucrase-Variante K373L wurde ein Fructan-Gemisch synthetisiert, das im Vergleich zum Produkt¬profil des Wildtyps einen höheren Anteil kurzkettiger Oligosaccharide aufwies. In einem dreistufigen Reinigungsprozess wurde das Produktgemisch im ersten Schritt von den Monosacchariden Glucose und Fructose sowohl fermentativ durch den Hefe¬stamm H. polymorpha als auch chromatographisch per Silicagel separiert. Anschließend erfolgte eine grobe Trennung der Oligosaccharide nach dem Größen¬ausschlussprinzip mit einer Bio-Gel®P2-Säule. Im letzten Schritt wurde die Oligosaccharidfraktion, die hauptsächlich Tri- und Tetrasaccharide enthielt, schließlich mittels Umkehrphasen-Säulenchromatographie (RP18-HPLC) in die gewünschten Produkte aufgetrennt. Auf diese Weise gelang es, die Oligosaccharide 1 Kestose (28 %), 6 Kestose (56 %) und 6 Nystose (20 %) in hoher Reinheit (> 95 %) und moderaten Ausbeuten zu isolieren (Übersicht 2). Der letzte Teil dieser Arbeit sollte die verschiedenen Disziplinen der Biokatalyse, chemischen Protein-Modifikation und Click-Reaktion mit einer neuen Kompontente, der Photokatalyse, verbinden und in einem innovativen Konzept die Grundlage für die Kombination dieser Forschungsbereiche schaffen. In diesem Kontext wurde einerseits eine lineare photo-biokatalysierte Kaskaden-Reaktion entworfen und vorbereitet, während andererseits die Synthese eines clickbaren Photokatalysators durchgeführt wurde (Übersicht 3). Für den enzymatischen Teil der Kaskaden-Reaktion wurden die Halogenasen RebH und RadH mit den zugehörigen Regenerationssystemen Fre und GDH erfolgreich in E. coli exprimiert, gereinigt und deren Aktivität nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein aktiver Alkin-funktionalisierter Photokatalysator synthetisiert, dessen Aktivität auch nach der Click-Reaktion mit einer Aminosäure und einem Peptid erhalten blieb. Damit wurden die Grundlagen geschaffen, um z. B. photoaktive Bausteine in ein Enzym einzubringen und somit neue lichtabhängige Reaktionszentren oder sogenannte Designer-Enzyme zu erzeugen.…
• Enzyme modifications occur in nature in the course of post-translational protein modifications and are fascinating mechanisms to increase the biological variety and function of proteins many times over. For a deep understanding of certain biological processes or enzymatic structure-function relationships, it is therefore essential to develop chemical methods that are able to mimic this natural diversity.[61] Probably the greatest challenge of chemical protein conjugation is the chemo- and regioselective modification of a particular amino acidEnzyme modifications occur in nature in the course of post-translational protein modifications and are fascinating mechanisms to increase the biological variety and function of proteins many times over. For a deep understanding of certain biological processes or enzymatic structure-function relationships, it is therefore essential to develop chemical methods that are able to mimic this natural diversity.[61] Probably the greatest challenge of chemical protein conjugation is the chemo- and regioselective modification of a particular amino acid while using mild and physiological reaction conditions. Despite numerous approaches to selective protein modification, new methods are still needed, as many existing strategies are customized for a specific system.[9, 63] Therefore, the aim of this work was to develop a widely applicable method for selective chemical tyrosine modification using the levansucrase from Bacillus megaterium as a model system. By a two-step protein modification consisting of an ene-reaction in the first step and a click-reaction in the second conjugation step, the product specificity of the Bm-levansucrase could be rationally controlled. In the early stages, the tyrosine-specific ene-reaction with luminol compound 1 was tested and analyzed on naturally occurring tyrosine residues. Mass spectroscopic investigations showed that mainly 2 of the 25 existing tyrosine residues were modified with luminol tag 1, including the tyrosines Y247 and Y196. In order to be able to interpret the effects of the tyrosine modification more easily and to exclude a mutual influence of the introduced side chains, the single mutant Y247F was used for further investigations. Since small changes in the product spectrum were observed after the first modification of the levansucrase variant Y247F, especially in the high molecular weight range, the second modification was carried out with the intention of intensifying this effect even further. Finally, the click reaction with azido¬glucose (AzGlc) in variant Y247F-1-AzGlc caused a significant shift in the product distribution from small fructooligosaccharides (approx. 1100 Da) to high molecular weight levan (approx. 2,1∙106 Da). Three further positions, located in the third zone of the enzyme, were selected for genetic substitution against non-native tyrosine residues. Thus, the variants E314Y, D248Y and F445Y were obtained and then chemically modified in two steps as described before. In terms of product distribution and polymer synthesis, the modification of these variants led to comparable results to those obtained with the enzyme Y247F (overview 1, A). To analyze the influence of different side chains regarding size and polarity, four additional azido compounds were tested in the click reaction in comparison to the azidoglucose. The results of the above-mentioned investigations and the consideration of molecular dynamic simulations allowed first conclusions about the mechanistic processes of the Bm levansucrase and its specific manipulation. The size of the introduced side chain as well as the ability of the tag to form polar interactions play an important role in the rational modulation of the product specificity. In particular, the spatial orientation and movement of the tag and the resulting steric hindrance helped to prevent premature dissociation of the growing fructans and thus enabled the processive polymer synthesis. Further insights into the levan elongation mechanism were obtained by modifying the variants N126Y and S125Y. In contrast to previously investigated tyrosine residues, these positions were not located in the oligosaccharide elongation pathway and further they had a shorter distance to the active centre. In both cases, already the first modification with luminol derivative 1 led to completely different product profiles. While the variant N126Y-1 showed a distinct accumulation (up to 800 % increase) of different oligo¬saccharides, the variant S125Y-1 synthesized levan polymer already after the first modification step (overview 1, B/C). The interactions and trajectories of the introduced side chain were again analyzed with the aid of MD simulations and confirmed the previous assumptions. Due to the proximity to the substrate binding pocket, the luminol tag of variant S125Y-1 was already sufficient to prevent substrate dissociation and to induce polymer synthesis. In contrast, the simulations revealed a very dynamic and fluctuating side chain for N126Y-1, which presumably led to the destabilization of initial interactions between the substrate and the protein surface and thus triggered the release and accumulation of short oligosaccharides. Finally, the bioorthogonal chemical introduction of an artificial side chain made it possible to steer the product spectrum of the Bm-levansucrase towards both polymer synthesis and short oligosaccharides. Using the tyrosine specific ene-reaction, native and non-native tyrosine residues were selectively modified and additionally derivatized in a subsequent reaction by click-chemistry. The effects of the modification reactions on the elongation mechanism of the substrate were elucidated by MD simulations. The goal of rationally influencing the product specificity of the levansucrase and controlling the product synthesis in a specific direction was thereby successfully achieved. Another focus of this work was to develop an efficient and simple method for the purification of a fructan mixture in order to facilitate the access to oligosaccharides of defined sizes. The availability of certain oligosaccharide lengths in sufficient quantity and purity would improve the investigation of fructans for their prebiotic properties and contribute to the understanding of the correlation between the intestinal microbiome and various diseases.[125] By using the levansucrase variant K373L, a fructan mixture with a higher content of certain oligosaccharides compared to the product profile of the wild type enzyme, was synthesized. In a three-step purification process, the first step was to separate the product mixture from the monosaccharides glucose and fructose both by fermentation using the yeast strain H. polymorpha and chromatographically by silica gel. Subsequently, the oligosaccharides were separated by size exclusion chromatography using a Bio-Gel®P2 column. In the last step, the oligosaccharide fraction, which mainly contained tri- and tetrasaccharides, was finally separated into the desired products by reversed phase column chromatography (RP18-HPLC). In this way it was successfully achieved to isolate the oligosaccharides 1 kestose (28 %), 6 kestose (56 %) and 6 nystose (20 %) in high purity (> 95 %) and moderate yields (overview 2). The last part of this work was intended to combine the different disciplines of biocatalysis, chemical protein modification and click reaction with the new component photocatalysis, and to create the basis for combining these research areas in an innovative concept. In this context a linear photo-biocatalysed cascade reaction was developed and prepared on the one side, while on the other side the synthesis of a clickable photocatalyst was performed (overview 3). For the enzymatic part of the cascade reaction the halogenases RebH and RadH with the corresponding regeneration systems Fre and GDH were successfully expressed, purified and their activity with the natural substrates was verified. In addition, an active alkyne-functionalized photocatalyst was synthesized, whose activity was retained even after the click reaction with an amino acid or peptide. This created the basis for introducing photoactive building blocks into larger structures or an enzyme and thereby generating new light-dependent reaction centres or so-called designer enzymes.…