Annika Kristina Seifert

• A multitude of human tissues, such as bones, tendons, or muscles, are characterized by a hierarchical and highly ordered structure. In many cases, the loss of these tissues requires reconstruction using biocompatible replacement materials. In the field of bone replacement, the pore structure of the material has a crucial influence. Anisotropic porosity would have the advantage of facilitating the ingrowth of cells and newly formed blood vessels as well as the transport of nutrients. In this thesis, scaffolds with a highly ordered andA multitude of human tissues, such as bones, tendons, or muscles, are characterized by a hierarchical and highly ordered structure. In many cases, the loss of these tissues requires reconstruction using biocompatible replacement materials. In the field of bone replacement, the pore structure of the material has a crucial influence. Anisotropic porosity would have the advantage of facilitating the ingrowth of cells and newly formed blood vessels as well as the transport of nutrients. In this thesis, scaffolds with a highly ordered and anisotropic pore structure were fabricated using unidirectional freezing. Systematic investigations were carried out on biopolymer solutions (alginate and chitosan) to gain a deeper understanding of the freeze-structuring process. The knowledge gained was then applied to the development of anisotropically structured bone substitute materials. Here, the previously existing material platform for anisotropically structured calcium phosphates was extended to low-temperature phases such as calcium deficient hydroxyapatite (CDHA) or the secondary phosphates monetite and brushite. After the implantation of a biomaterial, the inevitably triggered initial immune response plays a key role in the success of a graft, with immune cells such as neutrophils or macrophages being of particular importance. In this thesis, the influence of anisotropically structured alpha-TCP and CDHA scaffolds as well as their unstructured references on human monocytes/macrophages was investigated. Macrophages produced extracellular traps (ETs) due to mineral nanoparticles formed by the binding of phosphate and calcium ions to human platelet lysate. In particular, incubation of alpha-TCP samples in lysate containing cell culture medium resulted in pronounced particle formation and enhanced release of ETs.…
• Eine Vielzahl menschlicher Gewebe, wie beispielsweise Knochen, Sehnen oder Muskeln, ist durch eine hierarchische und zum Teil hochgradig geordnete Struktur gekennzeichnet. Der beispielsweise durch Unfälle oder Krankheiten bedingte Verlust dieser Gewebe erfordert in vielen Fällen eine Rekonstruktion mit biokompatiblen Ersatzmaterialien. Neben der chemischen Zusammensetzung spielt deren Architektur eine wichtige Rolle für die Geweberegeneration und schließlich den Heilungserfolg des Implantats. Auch im Bereich des Knochenersatzes hat dieEine Vielzahl menschlicher Gewebe, wie beispielsweise Knochen, Sehnen oder Muskeln, ist durch eine hierarchische und zum Teil hochgradig geordnete Struktur gekennzeichnet. Der beispielsweise durch Unfälle oder Krankheiten bedingte Verlust dieser Gewebe erfordert in vielen Fällen eine Rekonstruktion mit biokompatiblen Ersatzmaterialien. Neben der chemischen Zusammensetzung spielt deren Architektur eine wichtige Rolle für die Geweberegeneration und schließlich den Heilungserfolg des Implantats. Auch im Bereich des Knochenersatzes hat die Porenstruktur des Materials hierauf einen zentralen Einfluss, wobei der Einsatz von Materialien mit anisotroper Porosität neben der strukturellen Nachahmung des Gewebes den Vorteil hätte, dass das Einwachsen von Zellen und neu gebildeten Blutgefäßen sowie der Nährstofftransport erleichtert würden. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden anisotrop poröse Scaffolds mit einer hochgradig geordneten Porenstruktur mit Hilfe der Gefrierstrukturierung hergestellt. Hierfür wurde eine in früheren Arbeiten entwickelte Anlage verwendet, um einen definierten Temperaturgradienten in der Probe zur gerichteten Erstarrung zu erzeugen. Der Kern des Systems besteht aus zwei übereinander angeordneten Peltier-Elemente (PEs), zwischen denen sich die Probenlösung befindet. Durch die Variation der PE-Temperaturen kann das Eiskristallwachstum und schließlich die Porenstruktur innerhalb des Biomaterials gezielt beeinflusst und an die Anforderungen einer gewünschten Anwendung angepasst werden. Das Ziel dieser Arbeit war, ein tieferes Verständnis des Gefrierstrukturierungsprozesses zu erlangen und die gewonnenen Erkenntnisse auf die Entwicklung anisotrop poröser Knochenersatzmaterialien zu übertragen. Hierfür wurden in Kapitel 3 zunächst systematische Untersuchungen an Biopolymerlösungen (Alginat und Chitosan) durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass neben dem äußeren Temperaturgradienten auch die Temperaturen der PEs, die Kühlrate sowie Materialeigenschaften wie das Molekulargewicht, die Konzentration und die Viskosität der Lösung die Porenstruktur beeinflussen. Die Temperatur des Gesamtsystems bestimmte sowohl die Kühlrate als auch die Porendurchmesser, so dass höhere Kühlraten zu kleineren Poren führten. Die Porenorientierung konnte hingegen durch den externen Temperaturgradienten beeinflusst werden, wobei die Poren mit steigendem Gradienten zunehmend senkrecht zur Probenoberfläche orientiert ausgerichtet waren. Bestimmte Parameterkonstellationen, wie beispielsweise eine Temperatur der unteren Kühlfläche unterhalb von 60 °C kombiniert mit einer geringen Temperatur des oberen PE sowie eine hohe Viskosität (über 5 Pas nahe 0 °C) der Vorlösung führten allerdings dazu, dass die Porenausrichtung nicht mehr kontrollierbar war. Auf Basis von Kapitel 4 konnte die bis dato für anisotrop strukturierte Calciumphosphate existierende Materialplattform auf Niedrigtemperaturphasen wie calciumarmen Hydroxylapatit (CDHA) oder die sekundären Phosphate Monetit und Bruschit erweitert werden. Hierfür wurde gesintertes oder ungesintertes -Tricalciumphosphat (-TCP) mit anisotroper Porenstruktur durch hydrothermale Behandlung oder Inkubation in Phosphorsäure in die oben genannten Phasen umgewandelt. Durch die hydrothermale Behandlung konnte sowohl bei ungesinterten als auch bei gesinterten -TCP-Proben eine Phasenumwandlung in CDHA erzielt werden. Die Inkubation in Phosphorsäure führte zu einer Umwandlung in Monetit und Bruschit. Durch die hydrothermale Behandlung für 72 h bei 175 °C erhöhte sich die Porosität der ungesinterten Proben geringfügig von 85 % auf 88 %, während bei den gesinterten Proben ein Anstieg von 75 % auf 88 % zu beobachten war. Darüber hinaus ging eine Phasenumwandlung in CDHA durch die Bildung von feinen Kristallnadeln und -plättchen mit einer Vergrößerung der spezifischen Oberfläche einher. Hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften war besonders bemerkenswert, dass die Druckfestigkeit der ungesinterten Proben durch die Phasenumwandlung in Monetit signifikant von (0.76  0.11) auf (5.29  0.94) MPa erhöht wurde. In Kapitel 5 wurde der Einfluss von anisotrop porösen -TCP und CDHA Scaffolds sowie unstrukturierten und aus den gleichen Calciumphosphatphasen bestehenden Referenzproben auf humane Monozyten/Makrophagen untersucht. Nach der Implantation eines Biomaterials spielt die unweigerlich ausgelöste erste Immunreaktion eine Schlüsselrolle für den Erfolg eines Transplantats, wobei Immunzellen wie Neutrophile oder Makrophagen eine entscheidende Rolle spielen. Makrophagen können zur Immobilisierung und zum Abtöten von Mikroorganismen extrazelluläre Fasern (ETs) produzieren. Während in früheren Arbeiten nachgewiesen werden konnte, dass Neutrophile als Reaktion auf Biomaterialien ETs produzieren können, wurde dieser Mechanismus für Makrophagen erstmals in der vorliegenden Doktorarbeit gezeigt. Die ET-Freisetzung wurde von mineralischen Nanopartikeln ausgelöst, welche durch die Bindung von Phosphat- und Calciumionen an menschliches Thrombozytenlysat gebildet wurden. Insbesondere die Inkubation von  TCP Proben in lysathaltigem Zellkulturmedium führte zu einer ausgeprägten Partikelformierung und schließlich zu einer verstärkten Bildung von ETs. Dies ging mit einer erhöhten Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu CDHA einher. An diese Arbeit anschließende Experimente könnten beispielsweise die Wiederholung von systematischen Studien, wie sie in Kapitel 3 für Biopolymere vorgestellt wurden, mit synthetischen Polymeren wie Polyvinylalkohol (PVA) umfassen. PVA ist ein für den Einsatz als Kryoprotektor vielversprechendes Material, dessen Verwendung für die Kryokonservierung von biologischen Materialien zwingend notwendig ist. Darüber hinaus wäre die Durchführung von in vivo Experimenten erforderlich, um die starke Freisetzung von ETs durch Makrophagen als Reaktion auf strukturierte -TCP Scaffolds sowie die geringere Expression auf CDHA Scaffolds eingehender zu analysieren.…