Ka Yan Mak

• Amplification of N-MYC is a poor prognostic and survival marker of neuroblastoma. To broaden the scope of knowledge in N-MYC cancer biology, interactors of N-MYC should be investigated. TFIIIC complex was identified as a new protein interacting partner of N-MYC. TFIIIC is a core component of RNAPIII transcription machinery which is important for the synthesis of tRNA genes. TFIIIC recognizes and binds to B-box located internal of tRNA genes which subsequently initiate the RNAPIII transcription process. Apart from the role in RNAPIIIAmplification of N-MYC is a poor prognostic and survival marker of neuroblastoma. To broaden the scope of knowledge in N-MYC cancer biology, interactors of N-MYC should be investigated. TFIIIC complex was identified as a new protein interacting partner of N-MYC. TFIIIC is a core component of RNAPIII transcription machinery which is important for the synthesis of tRNA genes. TFIIIC recognizes and binds to B-box located internal of tRNA genes which subsequently initiate the RNAPIII transcription process. Apart from the role in RNAPIII transcription machinery, TFIIIC is an architectural protein. TFIIIC binds to thousands of sites across the genome without RNAPIII and TFIIIB. These binding loci are known as Extra TFIIIC (ETC) sites at which TFIIIC perform its role in genome organization. However, knowledge of TFIIIC is mostly restricted to studies conducted in yeasts, the exact function of TFIIIC and how it regulates N-MYC remains to be elucidated. To obtain a better overview about TFIIIC functions, two TFIIIC subunits (TFIIIC5 and TFIIIC2) which represent sub-complexes A and B were chosen for investigation. ChIP-seq experiment of RNAPIII transcription machinery was performed. It showed that both TFIIIC subunits functioned together as a complex. Next, joint binding sites of two TFIIIC subunits and N-MYC were identified. The data revealed that co-occupancies between N-MYC and TFIIIC subunits had different preference on genomic distribution. Furthermore, TFIIIC5 exhibited strong binding association with architectural proteins RAD21 and CTCF whereas TFIIIC2 was only modestly enriched with these two proteins. Both TFIIIC subunits showed equal but weak enrichment with accessory protein CAPH2. Despite the weak association with other architectural proteins, TFIIIC2 binds preferentially to repetitive elements SINE. In order to understand how TFIIIC5 affects other architectural proteins in chromatin binding, cells were depleted of TFIIIC protein upon doxycycline induction of shRNA. N-MYC binding was not affected. Yet, 50% reduction of RAD21 binding to joint N-MYC/TFIIIC sites was noticed. CAPH2 binding was increased at some joint sites while some did not respond. Lastly, CTCF did not show changes in binding under the effect of TFIIIC5 knockdown. In summary, the data indicated TFIIIC subunits from different sub-complexes diverge in functions other than tRNA synthesis. The association of TFIIIC5 with architectural proteins and TFIIIC2 with SINE elements were suggested to be distinct mechanisms to regulate N-Myc directly or indirectly.…
• Die Amplifikation von N-MYC ist ein schlechter Prognose- und Überlebensmarker für Neuroblastome. Um den Kenntnisstand über die Krebsbiologie von N-MYC zu erweitern, Interaktoren von N-MYC sollten untersucht werden. Der TFIIIC-Komplex wurde als neuer interaktiver Partner von N-MYC identifiziert. TFIIIC ist eine Kernkomponente der RNAPIIITranskriptionsmaschinerie, die für die Synthese von tRNA-Genen wichtig ist. TFIIIC erkennt und bindet an B-Box innerhalb von tRNA-Genen, die anschließend den RNAPIIITranskriptionsprozess initiieren. AbgesehenDie Amplifikation von N-MYC ist ein schlechter Prognose- und Überlebensmarker für Neuroblastome. Um den Kenntnisstand über die Krebsbiologie von N-MYC zu erweitern, Interaktoren von N-MYC sollten untersucht werden. Der TFIIIC-Komplex wurde als neuer interaktiver Partner von N-MYC identifiziert. TFIIIC ist eine Kernkomponente der RNAPIIITranskriptionsmaschinerie, die für die Synthese von tRNA-Genen wichtig ist. TFIIIC erkennt und bindet an B-Box innerhalb von tRNA-Genen, die anschließend den RNAPIIITranskriptionsprozess initiieren. Abgesehen von der Rolle in der RNAPIIITranskriptionsmaschinerie ist TFIIIC ein Architekturprotein. TFIIIC bindet an Tausende von Stellen im gesamten Genom ohne RNAPIII und TFIIIB. Diese Bindungsorte sind als Extra TFIIIC (ETC) -Stellen bekannt, an denen TFIIIC seine Rolle bei der Genomorganisation spielen kann. Das Wissen über TFIIIC beschränkt sich jedoch meist auf Studien, die mit Hefen durchgeführt werden. Die genaue Funktion von TFIIIC und die Art seiner Regulierung von NMYC sind noch zu klären. Um einen besseren Überblick über die TFIIIC-Funktionen zu erhalten, wurden zwei TFIIICUntereinheiten (TFIIIC5 und TFIIIC2) ausgewählt, die die Unterkomplexe A und B repräsentieren. Es wurde ein ChIP-seq-Experiment der RNAPIII-Transkriptionsmaschinerie durchgeführt. Es zeigte sich, dass beide TFIIIC-Untereinheiten zusammen als Komplex fungierten. Als nächstes wurden gemeinsame Bindungsstellen von zwei TFIIIC-Untereinheiten und N-MYC identifiziert. Die Daten zeigten, dass Co-Besetzungen zwischen N-MYC- und TFIIIC-Untereinheiten unterschiedliche Präferenzen bei der Verteilung von Genom hatten. Darüber hinaus zeigte TFIIIC5 eine starke Bindungsassoziation mit den Architekturproteinen RAD21 und CTCF, während TFIIIC2 mit diesen beiden Proteinen nur wenig angereichert war. Beide TFIIIC-Untereinheiten zeigten eine gleiche, aber schwache Anreicherung mit dem Zusatzprotein CAPH2. Trotz der schwachen Assoziation mit anderen Architekturproteinen bindet TFIIIC2 bevorzugt an repetitive Elemente SINE. Um zu verstehen, wie TFIIIC5 andere Architekturproteine bei der Chromatinbindung beeinflusst, wurden die Zellen bei der Doxycyclin-Induktion von shRNA an TFIIIC-Protein aufgebraucht. Die N-MYC-Bindung war nicht betroffen. Es wurde jedoch eine Verringerung der Bindung von RAD21 an gemeinsame N-MYC / TFIIIC-Stellen um 50% festgestellt. Die CAPH2-Bindung war an einigen gemeinsamen Stellen erhöht, während einige nicht reagierten. Schließlich zeigte CTCF keine Bindungsänderungen unter dem Einfluss von TFIIIC5-Knockdown. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass TFIIIC-Untereinheiten aus verschiedenen Unterkomplexen in anderen Funktionen als der tRNA-Synthese voneinander abweichen. Es wurde vermutet, dass die Assoziation von TFIIIC5 mit Architekturproteinen und TFIIIC2 mit SINE-Elementen unterschiedliche Mechanismen sind, um N-Myc direkt oder indirekt zu regulieren.…