Ulrich Frey

• Die klassische Signaltransduktionskaskade, auch MAP Kinase Kaskade genannt, ist wesentlich an der Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt. Proteinkinasen der Raf-Familie wirken dort als signalübertragende Elemente, welche Membranrezeptoren nachgeschaltet sind. Diese Proteine fungieren als Proto-Onkogene, eine Veränderung dieser Proteine kann sie in Onkogene überführen und sind wesentlich an der Krebsentstehung beteiligt. Während die Rolle von c-Raf als MEK-Aktivator innnerhalb des klassischenDie klassische Signaltransduktionskaskade, auch MAP Kinase Kaskade genannt, ist wesentlich an der Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt. Proteinkinasen der Raf-Familie wirken dort als signalübertragende Elemente, welche Membranrezeptoren nachgeschaltet sind. Diese Proteine fungieren als Proto-Onkogene, eine Veränderung dieser Proteine kann sie in Onkogene überführen und sind wesentlich an der Krebsentstehung beteiligt. Während die Rolle von c-Raf als MEK-Aktivator innnerhalb des klassischen Signaltransduktionsweges gut charakterisiert ist, so ist nur wenig über die beiden anderen Isoformen A-Raf und B-Raf bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei PC12 cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des Two-Hybrid Systems mit A-Raf und mit c-Raf zur Isolierung neuer Raf-Interaktionspartner untersucht. Für c-Raf wurden die Wechselwirkungen mit den bekannten Interaktionspartnern bestätigt, es wurden jedoch keine neuen Bindungspartner identifiziert. Im A-Raf Two Hybrid Screen konnte zum einen Prolyl 4-Hydroxylase als Schlüsselenzym der Kollagensynthese isoliert werden. Es wurde keine Wechselwirkung zwischen Prolyl 4-Hydroxylase und c-Raf oder B-Raf beobachtet. Die Prolyl 4-Hydroxylase Bindungsstelle konnte innerhalb der N-terminalen variablen Region von A-Raf lokalisiert werden. Zum anderen wurde die Pyruvatkinase M2 als A-Raf spezifischer Bindungspartner identifiziert. Für diese Wechselwirkung war die c-terminale Region von A-Raf ausreichend. Durch Mutation zweier Aminosäuren im c-terminalen Teil von A-Raf konnte diese Wechselwirkung verhindert werden, wobei die Interaktion zu MEK und Ras dadurch nicht beeinträchtigt wurde. Ein kooperativer Effekt auf die Zelltransformation wurde durch Co-Transfektion von NIH Zellen mit onkogenem A-Raf und Pyruvatkinase M2 gezeigt. Diese führte zu doppelt so vielen Foci wie die Transfektion mit A-Raf alleine. Die Mutation der mutmaßlichen ATP-Bindungsstelle der Pyruvatkinase M2, welche die A-Raf Pyruvatkinase M2 Kooperation blockieren sollte, verhinderte diesen synergistischen Effekt. Diese Ergebnisse weisen auf eine Regulation der Pyruvatkinase M2 durch A-Raf hin und lassen den Schluss zu, dass die funktionelle Interaktion mit der Pyruvatkinase M2 durch onkogenes A-Raf für die Zelltransformation notwendig ist. Als zwei neue Raf-Interaktionspartner wurden Prolyl 4-Hydroxylase und Pyruvatkinase M2 identifiziert, welche Raf-Isoform spezifische Bindung zeigen. Auf diese Weise konnte eine direkte Verbindung zwischen der transformierenden MAP Kinase Kaskade und dem Energiestoffwechsel hergestellt werden.…
• The MAP Kinase cascade belongs to a highly conserved signal transduction pathway and is crucial for the regulation of various cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. Protein kinases of the Raf family serve as signal transducing proteins, which play an important role downstream of cellular membrane receptors. These proteins act as proto-oncogenes as they may be mutated into oncogenes which are substantially involved in the development of cancer. Whereas the role of c-Raf as a MEK activator is well established onlyThe MAP Kinase cascade belongs to a highly conserved signal transduction pathway and is crucial for the regulation of various cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. Protein kinases of the Raf family serve as signal transducing proteins, which play an important role downstream of cellular membrane receptors. These proteins act as proto-oncogenes as they may be mutated into oncogenes which are substantially involved in the development of cancer. Whereas the role of c-Raf as a MEK activator is well established only little is known about the other two isoforms, A-Raf and B-Raf. In the context of this work two PC12 cDNA library were analysed using the yeast Two-Hybrid system with A-Raf and c-Raf as baits in order to isolate new Raf-interacting proteins. The Two hybrid screen with c-Raf resulted in the confirmation of already known interacting partner. No unknown interacting proteins were identified. The A-Raf screen yielded in the identification of prolyl 4-hydroxylase as a key enzyme of collagen synthesis. No positive interaction between c-Raf or B-Raf and prolyl 4-hydroxalase was detected. The binding domain of A-Raf could be mapped to the variable regulatory N-terminal region. As another new interacting protein of A-Raf Pyruvate kinase M2 (PK M2) was identified in this two hybrid screen. No positive interaction with c-Raf or B-Raf was detectable. The binding region of A-Raf was localized at the c-terminal kinase domain. Mutation of two amino acids within this domain resulted in an inhibition of interaction to PK M2, whereas the A-Raf binding to MEK or Ras was not abolished. An cooperative effect in cell transformation has been shown after co-transfection of NIH cells with A-Raf and PK M2. This co-transfection resulted in twice as much focus formation compared to transfection of A-Raf alone. The mutation of the putative ATP-binding site of PK M2, which should block the A-Raf PK M2 interaction inhibited this synergistic effect. These results point out A-Raf as a regulator of PK M2 and indicate that the functional interaction of oncogenetic transformed A-Raf with PK M2 is necessary for cell transformation. Using the yeast two hybrid-system two new A-Raf interacting proteins were identified: prolyl 4-hydroxylase and PK M2. The interaction to A-Raf was isoform specific as no positive interaction to B-Raf or c-Raf was detectable. Thus a direct link between the signal transduction pathway and the energy metabolism could be established.…