Untersuchungen zu intrazellulären Folgereaktionen von Neisseria meningitidis und Escherichia coli K1 in HBMEC (human brain microvascular endothelial cells)

Intracellular survival and replication of Neisseria meningitidis and Escherichia coli K1 in HBMEC (human brain microvascular endothelial cells)

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-16552
  • Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenigNeisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden.show moreshow less
  • In order to cause meningitis the extracellular pathogen Neisseria meningitidis has to traverse the blood-brain-barrier (BBB). It remains unclear, if the passage occurs through a transcellular or paracellular pathway. Postulating a transcellular passage, meningococci (MC) have been shown to adhere to and enter into BBB forming human brain microvascular endothelial cells (HBMECs). Furthermore, electron microscopy studies demonstrate that intracellular MC reside within membrane-bound compartments both solitary and in groups. Whether this is aIn order to cause meningitis the extracellular pathogen Neisseria meningitidis has to traverse the blood-brain-barrier (BBB). It remains unclear, if the passage occurs through a transcellular or paracellular pathway. Postulating a transcellular passage, meningococci (MC) have been shown to adhere to and enter into BBB forming human brain microvascular endothelial cells (HBMECs). Furthermore, electron microscopy studies demonstrate that intracellular MC reside within membrane-bound compartments both solitary and in groups. Whether this is a result of simultaneous uptake or vacuole fusion or possible intracellular replication needs to be assessed. In order to investigate the ability of MC to survive and replicate intracellularly, prolonged gentamicin protection assays were performed using human epithelial (HEp-2) and endothelial (HBMEC) cells. Cells were infected with encapsulated and unencapsulated N. meningitidis serogroup B mutants in order to identify the potential role of the polysaccharide capsule for the intracellular survival. Encapsulated bacteria were found to be able to survive and, after an initial delay, to replicate within both endothelial and epithelial cells, whereas the number of intracellular capsule-deficient mutants decreased continuously. This strongly suggests that the capsule plays a pivotal role for the intracellular survival of MC both in epithelial and endothelial cells. Further investigations were initiated to characterise the membran-bound compartment, the Neisseria containing vacuole (NCV). Immunfluorescence microscopy studies showed that NCV acquire the early endosomal marker protein transferrin receptor and the lysosomal marker protein Lamp-1 respectively. The acquisition of further marker proteins as well as the kinetics of the association of these with NCV remain to be studied.show moreshow less

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Metadaten
Author: Joanna Nikulin
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-16552
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Medizinische Fakultät / Institut für Hygiene und Mikrobiologie
Date of final exam:2005/12/23
Language:German
Year of Completion:2005
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Tag:Escherichia coli K1; HBMEC; Meningitis; Neisseria meningitidis; intrazellulär
Escherichia coli K1; HBMEC; Neisseria meningitidis; intracellular; meningitis
Release Date:2006/01/26
Advisor:Prof. Dr. med. Matthias Frosch