Entwicklung neuartiger bakterieller Vektoren zur Übertragung von zellassoziierten Antigenen, DNA und RNA auf der Basis virulenzattenuierter L. monocytogenes

Development of novel bacterial carrier strains for the delivery of cell wall associated antigens, DNA and RNA on the basis of virulence attenuated Listeria monocytogenes

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-16560
  • Listeria monocytogenes ist ein fakultativ humanpathogenes Bakterium und aufgrund seiner Fähigkeit, in Zellen des Wirtes einzudringen und sich im Zytoplasma der befallenen Wirtszelle zu vermehren, ein attraktiver Träger, um heterolog exprimierte Antigene in den MHC-I- und -II-Präsentationsweg antigenpräsentierender Zellen (APC) einzuschleusen und so eine effektive zelluläre Immunreaktion zu erzeugen. Dabei hat die Art und Weise der Antigenexpression einen wesentlichen Einfluss auf die Erzeugung der antigenspezifischen Immunität. So konnte unterListeria monocytogenes ist ein fakultativ humanpathogenes Bakterium und aufgrund seiner Fähigkeit, in Zellen des Wirtes einzudringen und sich im Zytoplasma der befallenen Wirtszelle zu vermehren, ein attraktiver Träger, um heterolog exprimierte Antigene in den MHC-I- und -II-Präsentationsweg antigenpräsentierender Zellen (APC) einzuschleusen und so eine effektive zelluläre Immunreaktion zu erzeugen. Dabei hat die Art und Weise der Antigenexpression einen wesentlichen Einfluss auf die Erzeugung der antigenspezifischen Immunität. So konnte unter Verwendung extrazellulärer Trägerbakterien gezeigt werden, dass insbesondere die Verankerung von Antigenen auf der Zelloberfläche der Bakterien zu einer effektiven Induktion einer humoralen Immunantwort führt. Mit dem Ziel, mit einem derartigen Ansatz auch eine zelluläre Immunität zu erzeugen, wurde ein Plasmidsystem für die Expression von heterologen Proteinen in der Zellwand von L. monocytogenes entwickelt. Dabei gelang die Verankerung zahlreicher Proteine eukaryontischer wie auch prokaryontischer Herkunft über das LPXTG-Ankermotiv von Internalin A. Die so erzielte starke Expression in der Zellwand setzte aber sowohl die Fitness der Bakterien als auch deren Invasivität in vitro deutlich herab und verhinderte damit eine effektive MHC-I-Präsentation des verwendeten Modellantigens. Alternativ wurde L. monocytogenes bereits erfolgreich zur Übertragung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um so auch die Synthese gegebenenfalls posttranslationell modifizierter Antigene in ihrer korrekten Konformation durch die infizierte Wirtszelle zu erzielen. Allerdings erfolgte die Expression des als Reporterprotein verwendeten EGFP insbesondere in APC sehr langsam und war von geringer Effizienz. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass nach bakterieller Übertragung von DNA-Vakzinen der Import der Plasmidmoleküle in den Kern insbesondere sich nicht teilender Zellen einen der wichtigsten Engpässe für eine möglichst frühzeitige und effektive Reportergenexpression darstellt. Einen Ausweg bietet die bakterielle Übertragung codierender mRNA, die unmittelbar nach der Freisetzung aus der Bakterienzelle im Zytoplasma der infizierten Wirtszelle zur Translation zu Verfügung steht. Dazu wurde das 5’-Ende der EGFP-codierenden Sequenz mit dem IRES-Element des Encephalomyocarditisvirus genetisch fusioniert. Um eine möglichst hohe Syntheserate zu erzielen und damit dem Abbau der mRNA in der Bakterienzelle entgegenzuwirken, erfolgte die Synthese der mRNA in L. monocytogenes mit Hilfe eines T7-RNA-Polymerase-basierten Transkriptionssystems. Im Gegensatz zur bakteriellen Übertragung von Plasmid-DNA konnte so bereits 4 h nach Infektion sowohl in epithelialen als auch in APC wie Makrophagen und humanen dendritischen Zellen eine deutliche EGFP-Expression nachgewiesen werden sowie bei Verwendung von Ovalbumin als Reporterprotein eine effektive MHC-I-Präsentation in vitro. Damit stellt die bakterielle Übertragung von mRNA einen vielversprechenden neuartigen Ansatz dar zur Erzeugung einer zellulären und gegebenenfalls auch humoralen Immunantwort gegen posttranslational modifizierte Antigene.show moreshow less
  • Listeria monocytogenes is a facultative intracellular bacterium that enters the cell by phagocytosis after which it colonizes the cytosol of the host cell. It is thus a potent vaccine vector for the presentation of passenger antigens to the major histocompatibility complex class II and class I pathways. The mode of antigen expression has a major impact on the generation of a specific immune response. Compared to the expression of antigens in a secreted form or localized inside the bacterial cell, the display of heterologous antigens on theListeria monocytogenes is a facultative intracellular bacterium that enters the cell by phagocytosis after which it colonizes the cytosol of the host cell. It is thus a potent vaccine vector for the presentation of passenger antigens to the major histocompatibility complex class II and class I pathways. The mode of antigen expression has a major impact on the generation of a specific immune response. Compared to the expression of antigens in a secreted form or localized inside the bacterial cell, the display of heterologous antigens on the surface of bacteria has shown to be a potent strategy for the elicitation of efficient immune responses. Therefore, a plasmid system for the expression of heterologous proteins covalently linked to the cell wall of L. monocytogenes via the LPXTG cell wall anchor of Internalin A was developed. Although efficient expression of a number of proteins could be achieved by this approach the resulting high expression levels in turn reduced the invasiveness and overall fitness of the carrier Listeria and thus impaired the delivery efficiency of the encoded antigen to the antigen processing machinery of the infected host cell. As an alternative approach to the delivery of protein antigens synthetisized by the prokaryotic cell Listeria might also be exploited for the delivery of DNA vaccines enabling the correct expression also of posttranslationally modified passenger antigens by the eukaryotic cell. However, it is demonstrated that the uptake of the plasmid DNA into the nucleus is a major limiting step for achieving early and efficient gene expression in non-dividing and therefore also in antigen presenting cells. Comparable to other non-viral transfection techniques like lipofection, the limited access to the nuclear compartment may thus constitute a major barrier also after bacteria-mediated expression plasmid DNA delivery. To overcome this bottleneck, a self-destructing L. monocytogenes strain was employed for the release of translation-competent mRNA directly into the cytosol of epithelial cells, macrophages and human dendritic cells. EGFP-encoding mRNA, adapted for translation in mammalian cells by linking an IRES element to the 5´- end of the egfp coding sequence, was produced by T7 RNA polymerase in the carrier bacteria upon entry into the cytosol where the mRNA is efficiently released from the lysed bacteria and immediately translated in eukaryotic host cells. Besides the much earlier expression of EGFP being detectable already 4 h after infection, the number of EGFP expressing mammalian cells obtained with this novel RNA delivery technique is comparable to or - especially in phagocytic cells - even higher than that obtained with the expression plasmid DNA delivery strategy. Accordingly, bacteria-mediated delivery of ovalbumin-encoding mRNA to macrophages resulted in efficient antigen processing and presentation in vitro. In conclusion, this approach might also be adapted for the in vivo delivery of antigen-encoding mRNA leading to a more efficient immune response also against posttranslationally modified antigens such as viral envelope proteins and thus might lead to the development of novel vaccines.show moreshow less

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Metadaten
Author: Christoph Schoen
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-16560
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Biologie
Faculties:Fakultät für Biologie / Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Date of final exam:2006/01/25
Language:German
Year of Completion:2005
Source:Cellular Microbiology
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
GND Keyword:Listeria monocytogenes; Impfstoff; DNS
Tag:DNA delivery; Impfstoffe; Listeria monocytogenes; RNA delivery
DNA delivery; Listeria monocytogenes; RNA delivery; antigen delivery; recombinant vaccines
Release Date:2006/01/26
Advisor:Prof. Dr. Werner Goebel