Kallal Pramanik

• In spite of the progress made in deciphering regulatory networks of cancer cells on the molecular level, the interaction of tumour cells with their stroma has not been adequately analyzed. Earlier, we have addressed the hypothesis that the murine embryonic microenvironment can induce the differentiation of human tumour cells. To examine such interactions, human leukaemic AML cells were injected into pre-implantation murine blastocysts at embryonic day 3.5 of gestation. Analysis of developing mice revealed the presence of human AML cells inIn spite of the progress made in deciphering regulatory networks of cancer cells on the molecular level, the interaction of tumour cells with their stroma has not been adequately analyzed. Earlier, we have addressed the hypothesis that the murine embryonic microenvironment can induce the differentiation of human tumour cells. To examine such interactions, human leukaemic AML cells were injected into pre-implantation murine blastocysts at embryonic day 3.5 of gestation. Analysis of developing mice revealed the presence of human AML cells in chimaeric embryos and adults and the appearance of haematopoietic differentiation markers on progeny of injected human AML cells. This finding strengthens the notion that the embryonic microenvironment is capable of regulating the proliferation and differentiation of leukaemic AML cells. Based on these results, I embarked to analyse the consequences of stromal environment-induced changes in human AML cells upon in vitro coculture with selected haematopoietic stromal cell lines in terms of changes in differentiation and proliferation properties of AML cells. For this purpose, established human AML cell lines were cocultured on a variety of mitotically inactivated stromal cell lines derived from different murine embryonic/foetal haematopoietic sites such as yolk sac, aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and foetal liver. To score for coculture-induced changes, I compared the morphology, histo-chemical properties, immunophenotype, proliferation rate, and gene expression profile in cocultured and non-cocultured AML cells. Results show that, upon coculture of Kasumi-1 cells- a cell line established from a FAB class M2 patient - with AGM-derived DAS 104-4, but not with other stromal cell lines, Kasumi-1 AML cells exibit decreased proliferation and colony formation capabilities and acquire differentiated morphologies. Along this line, coculturing of Kasumi-1 cells resulted in the up-regulation of the myelo-monocytic lineage cell surface markers CD11b and CD14. Coculture also resulted in increase in lysosomal marker CD68, a hallmark of myeloid differentiation. Interestingly, apart from cell lines, coculture on DAS 104-4 stroma was also efficient in inducing myeloid differentiation of patient derived primary M2-AML cells. Moreover, cocultivation of KG-1 cell line on DAS 104-4 showed activation of -globin transcription and up-regulation of Glycophorin A on its surface, which indicate DAS 104-4 coculture-induced erythroid differentiation of KG-1 cells. Analysis of the proliferation rate of Kasumi-1 cells using the CFSE retention assay revealed that upon cocultivation on DAS 104-4, but not on NIH 3T3 cells, there is a decrease both in the proliferation rate and in the frequency of colony forming cells in clonogenic methyl cellulose cultures. Cell cycle analysis revealed the coculture-induced accumulation of G1-G0 stage cells. Gene-expression analysis by quantitative RT-PCR revealed a substantial decrease in the amount of AML1 and AML1-ETO fusion transcripts in parallel with an increase in p16, p21, C/EBP and PU.1 transcription levels. Interestingly, AML1-ETO transcription down-regulation of AML cells needs direct contact with DAS 104-4 cells. Knocking down AML1-ETO expression by siRNA strategy led to reduction in proliferation and depletion of colony forming cells in Kasumi1 cell population. siRNA-mediated AML1-ETO knock-down Kasumi-1 cells showed increased susceptibility to stroma-induced myeloid differentiation. However, on its own, AML1-ETO down-regulation was not sufficient to induce myeloid differentiation. This indicates that AML1-ETO down-regulation may have an active role on the coculture-induced effect but in addition to AML1-ETO down-regulation, further stimuli are required for the coculture-induced myeloid differentiation in the AML cells. In summary, in the present study I established and characterised a coculture-based in vitro system, which is capable of reducing the proliferation while inducing differentiation of human AML cells. The concept emerging from the studies indicates that the stroma environment can affect leukaemic cell proliferation and differentiation in contact-dependent and CD44 activation-independent manner. Furthermore, this study emphasizes the role of AML1-ETO in AML and indicates that AML1-ETO down-regulation is involved in the stroma-induced differentiation of Kasumi-1 cells. The result described here encourages further investigation into the mechanistic details of molecular and cellular interactions between the leukaemic cells and their stroma, which in turn may lead to the identification of new paradigms for a knowledge-based control and reprogramming of leukaemic cells.…
• Neuere Erkenntnisse in der Tumorforschung belegen, dass die Mikroumgebung neben anderen Faktoren eine bedeutende Komponente im komplexen regulatorischen Netzwerk von Tumorzellen darstellt. Doch obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte hinsichtlich des molekularen Verständnisses der Tumorzell-Regulation gemacht wurden, wurden die Interaktionen zwischen Tumor- und Stromazellen bislang nur unzureichend analysiert. In früheren Untersuchungen stellten wir die Hypothese auf, dass die murine embryonale Mikroumgebung humane Tumorzellen zurNeuere Erkenntnisse in der Tumorforschung belegen, dass die Mikroumgebung neben anderen Faktoren eine bedeutende Komponente im komplexen regulatorischen Netzwerk von Tumorzellen darstellt. Doch obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte hinsichtlich des molekularen Verständnisses der Tumorzell-Regulation gemacht wurden, wurden die Interaktionen zwischen Tumor- und Stromazellen bislang nur unzureichend analysiert. In früheren Untersuchungen stellten wir die Hypothese auf, dass die murine embryonale Mikroumgebung humane Tumorzellen zur Differenzierung anregen kann. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, wurden humane AML-Zellen in murine Blastozysten injiziert und diese in scheinträchtige Ammentiere implantiert. Humane Zellen konnten sowohl in den sich entwickelnden Embryonen als auch in daraus hervorgegangenen adulten Tieren nachgewiesen werden. Außerdem exprimierten die Nachkommen der injizierten AML-Zellen hämatopoetische Differenzierungsmarker. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass die embryonale Mikroumgebung in der Lage ist, die Proliferation und Differenzierung humaner Leukämiezellen zu beeinflussen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen habe ich damit begonnen, die Stroma-vermittelten Veränderungen in humanen AML-Zellen hinsichtlich ihres Proliferations- und Differenzierungsverhaltens in einem in vitro Kokultur-System zu untersuchen. Hierzu wurden etablierte humane AML-Zelllinien mit verschiedenen murinen Stromazelllinien kokultiviert, die embryonalen hämatopoetisch aktiven Geweben (Dottersack, Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region, foetale Leber) entstammen. Anschließend wurden verschiedene Parameter, wie Morphology, Histochemie, Immunphänotyp, Proliferationsrate und Expression bestimmter Gene, kokultivierter und nicht kokultivierter AML-Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigen für Kasumi-1 Zellen, eine etablierte humane Leukämie-Zelllinie vom AML FAB-Typ M2, dass die Kokultur mit DAS 104-4, einer murinen Sromazelllinie, die der AGM-Region entstammt, eine Reduzierung der Proliferations- und Koloniebildungs-Fähigkeit hervorruft und sich die Morphologie der AML-Zellen in Richtung eines differenzierteren Zelltyps ändert. Übereinstimmend damit können nach Kokultur die myelo-monozytären Differenzierungsmarker CD11b und CD14 auf der Oberfläche der Kasumi-1-Zellen nachgewiesen werden. Die Kokultur führte ebenfalls zu einer Zunahme des lysosomalen Markers CD68, der ebenfalls eine myeloide Differenzierung kennzeichnet. Bemerkenswert ist, dass DAS 104-4 Stromazellen in der Lage sind, myeloide Differenzierung auch in primären M2-AML-Zellen aus einem leukämischen Patienten zu induzieren. Außerdem wurde in KG-1 AML Zellen nach Kokultur mit DAS 104-4 eine Aktivierung der -Globin-Transkription und eine verstärkte Glycophorin-A-Expression beobachtet, was auf eine Differenzierung der KG-1-Zellen in Richtung erythroide Linie hindeutet. Untersuchungen zur Proliferationsfähigkeit von Kasumi-1-Zellen mittels CFSE-Retentions-Messungen ergaben, dass nach Kokultur mit DAS 104-4 - nicht aber mit NIH 3T3-Kontrollzellen - die Zellteilungsrate vermindert ist. Gleiches gilt für die Koloniebildungs-Kapazität in Methylzellulose-Kulturen. Zellzyklus-Analysen zeigen eine kokulturinduzierte Akkumulation der AML-Zellen im G1-G0 Stadium. Genexpressionsanalysen mit Hilfe quantitativer RT-PCR verweisen auf eine deutlich herabgesetzte Transkription von AML1 und dem AML1-ETO-Fusionsgen, verbunden mit einem Anstieg der p16-, p21-, C/EBP und PU.1-Transkription. Interessanterweise ist die Abnahme von AML1-ETO Transkripten abhängig vom direkten Zellkontakt zwischen AML- und DAS 104-4-Zellen. Wird die AML1-ETO-Expression nach Einsatz spezifischer siRNA herunter reguliert, führt dies zu einer verminderten Proliferation und zur Depletion koloniebildender Zellen innerhalb der Kasumi-1-Population. Außerdem bewirkt der siRNA-vermittelte knockdown von AML1-ETO eine höhere Empfänglichkeit der Kasumi-1-Zellen für die Stroma-induzierte myeloide Differenzierung. Die Verringerung von AML1-ETO Transkripten allein hat allerdings keinen differenzierenden Effekt. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass AML1-ETO zwar aktiv an der kokultur-vermittelten Reaktion beteiligt ist, dass aber zusätzliche Stimuli nötig sind, um myeloide Differenzierung in den AML-Zellen auszulösen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in der vorliegenden Arbeit ein Kokultur-basiertes in vitro System entwickelt und charakterisiert wurde, das in der Lage ist, die Proliferationsfähigkeit von humanen AML-Zellen zu senken und ihre Differenzierung in die myeloide Linie zu induzieren. Aus den dargestellten Ergebnissen lässt sich schließen, dass das umgebende embryonale Stroma die Proliferation und Differenzierung leukämischer Zellen beeinflussen kann. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind abhängig vom direkten Kontakt zwischen Stroma- und AML-Zellen. Eine CD44-Aktivierung konnte nicht beobachtet werden. Weiterhin liefert die vorliegende Arbeit Hinweise darauf, dass die Verminderung der AML1-ETO-Transkription ein bedeutendes, jedoch nicht das allein auslösende, Ereignis der stroma-induzierten Differenzierung von Kasumi-1-Zellen darstellt. Die hier beschriebenen Resultate regen zu weiterführenden Untersuchungen an, die Aufschluss über zelluläre und molekulare Details der Interaktionen zwischen Leukämischen und Stromazellen geben sollen. Neue Erkenntnisse über die beteiligten Mechanismen könnten den Ansatz bieten, der es erlaubt, leukämische Zellen aktiv zu kontrollieren und zu reprogrammieren.…