Olaf Pöppelmeier

• Funktionelle Analyse des Polymorphismus im Promotor des 24-Hydroxylase-Gens Ziel dieser Arbeit war es, in der Arbeitsgruppe eindeutig nachgewiesene Polymorphismen im Promotor des 24Hydroxylasegens, auf eine funktionelle Relevanz zu untersuchen. Die Substrate des Enzyms CYP24 sind 1,25(OH)2D3 und 25(OH)D3. Die entsprechenden Produkte der Katalyse sind 1,24,25(OH)3D3 und 24,25(OH)2D3. Über das erste Produkt wird das hochpotente 1,25(OH)2D3 im Sinne einer negativen Rückkopplung abgebaut. Dem zweiten Produkt 24,25(OH)2D3, konnte die Funktion alsFunktionelle Analyse des Polymorphismus im Promotor des 24-Hydroxylase-Gens Ziel dieser Arbeit war es, in der Arbeitsgruppe eindeutig nachgewiesene Polymorphismen im Promotor des 24Hydroxylasegens, auf eine funktionelle Relevanz zu untersuchen. Die Substrate des Enzyms CYP24 sind 1,25(OH)2D3 und 25(OH)D3. Die entsprechenden Produkte der Katalyse sind 1,24,25(OH)3D3 und 24,25(OH)2D3. Über das erste Produkt wird das hochpotente 1,25(OH)2D3 im Sinne einer negativen Rückkopplung abgebaut. Dem zweiten Produkt 24,25(OH)2D3, konnte die Funktion als Botenstoff in der Knochenheilung und -entstehung nachgewiesen werden. Detailliertere Ergebnisse gibt es insbesondere für Chondrozyten in der Ruhezone der Epiphysefuge. Der Promotor des CYP24-Gens ist mit zwei Vitamin D-responsiven Elementen (VDREs) ausgestattet, welche die Transkriptionsrate des Gens in Anwesenheit von 1,25(OH)2D3 schnell und deutlich steigern. In einer poly-A-Strecke, die 488bp upstream des Transkriptionsstarts auffiel, konnte ein Polymorphismus nachgewiesen werden, die häufigsten Allele wurden als +A, +2A, und +C5AC bezeichnet. Mittels PCR wurden aus humaner, genomischer DNA, 672-680bp lange Promotorfragmente mit TATA-box, den beiden bekannten VDREs und dem polymorphen Bereich hergestellt. Diese Promotorfragmente wurden in den pGL3 Basic Vektor (ein für Luziferase kodierendes Plasmid ohne Promotor) kloniert und die Sequenz dieser Vektor-Promotorkonstrukte durch Fragmentanalyse und Sequenzierung kontrolliert. Die Vektor-Promotorkonstrukte wurden dann mittels Elektroporation in hFOB und T/C28 Zellen transfiziert. Es wurden Versuchsreihen unter basalen Bedingungen und unter Stimulation mit1,25(OH)2D3 durchgeführt. Anhand von Kontrollkonstrukten konnte die Spezifität der Promotoraktivität gezeigt werden. Für die Promotoren, die das Allel +A enthielten, konnte eine Verdoppelung und für die mit dem Allel +2A eine Verdreifachung der Luziferaseaktivität gezeigt werden. Das Allel +C5AC wies ähnliche Promotoraktivitäten wie der Wildtyp auf. Unter Stimulation mit 1,25(OH)2D3 war in allen Konstrukten mit einem Promotor in korrekter Orientierung eine mindestens dreifache Steigerung der Luziferaseaktivität zu messen. Sowohl Abwesenheit als auch in Anwesenheit von 1,25(OH)2D3 wird die Aktivität des Promotors des CYP24-Gens durch die Allele +A und +2A signifikant (p<0,001) gesteigert. Demzufolge könnte der Polymorphismus auch unter physiologischen Bedingungen Einfluss auf die Transkriptionsrate des CYP24-Gens haben. Da die CYP24-Aktivität vor allem über die Transkription reguliert wird, müsste durch den beschriebenen Polymorphismus die Aktivität des Enzyms in vivo gesteigert werden. In Folge könnte es lokal oder systemisch zu niedrigeren 1,25(OH)2D3- oder erhöhten 24,25(OH)2D3-Spiegeln kommen. Potentielle Bedeutung hat dieser Befund in der Pathogenese von Osteoporose, dem Prostatakarzinom oder anderen Erkrankungen die mit veränderten 1,25(OH)2D3 Aktivitäten einhergehen. Gegenwärtig wird bereits nach SNPs gefahndet die mit dem beschriebenen Polymorphismus assoziiert sind, um Untersuchungen von größeren Kollektiven auf diesen Polymorphismus hin zu erleichtern. Bell et al. konnten Veränderungen von CYP24-aktivitäten in Fibroblastenkulturen in Abhängigkeit von ethnischer Herkunft zeigen. Möglicherweise könnte das CYP24-Gen eines von zahlreichen Kandidatengenen sein, die bei der Entstehung von Osteoporose von Relevanz sind, und in ein System zur Risikoanalyse mit einfließen. Es könnten zum Beispiel über den Einsatz von zu entwickelnden „Single Nucleotid Polymorphims Gen-Chips“ solche Risikoprofile relativ einfach erstellt werden. In Folge könnten sowohl in der Prophylaxe als auch in der Therapie von Osteoporose neue Möglichkeiten geschaffen und neue Perspektiven eröffnen werden.…
• Functional analysis of the polymorphism in the promotor of the 24-Hydroxylase gene Aim: A functional characterisation of the Polymorphism in the promotor of the 24-hydroxylase (CYP24) gene. The enzyme CYP24 initiates the degradation of the active vitamin D metabolite 1,25(OH)D3 as well as catalysing the production of 24,25(OH)D3, an active metabolite bone metabolism. If the polymorphism influenced the activity of CYP24, local or systemic levels of vitamin D could be altered or bone metabolism disturbed by varying 24,25(OH)D3 levels. TheFunctional analysis of the polymorphism in the promotor of the 24-Hydroxylase gene Aim: A functional characterisation of the Polymorphism in the promotor of the 24-hydroxylase (CYP24) gene. The enzyme CYP24 initiates the degradation of the active vitamin D metabolite 1,25(OH)D3 as well as catalysing the production of 24,25(OH)D3, an active metabolite bone metabolism. If the polymorphism influenced the activity of CYP24, local or systemic levels of vitamin D could be altered or bone metabolism disturbed by varying 24,25(OH)D3 levels. The polymorphism could a factor in the pathogenesis of osteoporosis or other diseases of the skeletal system. Methods: Four different alleles of the polymorphism in the promotor of the CYP24 gene (WT, +A, +2A and +C5AC) as well as controls were amplified using PCR and cloned into a luciferase assay vector (pgl3-basic). Using electroporation the vector was transfected into two different cell systems, h-fob cells (human Osteoblasts) and T/C28a2 cells (human Chondrocytes). The cells were cultivated with and without the influence of vitamin D. The promotor activity was quantified using the luciferase assay. Results: By comparison with the controls a specific promotor activity could be demonstrated. For the allele +A a two fold increase and for the allele +2A a three fold increase in promotor activity compared to the wild type promotor was measured (p<0,001). The allele +C5AC showed no significant influence on the promotor activity. Under influence of vitamin D promotor activity was increase at least three times as high as in the basic setting. Discussion: Since the activity of the enzyme CYP24 is controlled mainly by the rate of transcription, the polymorphism in the promotor of the gene could influence CYP24 activity in vivo. The result could be a local or systemic decrease of 1,25(OH)D3 levels or increase of 24,25(OH)D3 levels. The polymorphism might therefore be relevant in the pathogenesis of osteoporosis, prostate cancer or other diseases associated with decreased levels of vitamin D.…