Transportrelevante Substratinteraktionen des organischen Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1)
Substrate interactions of rat organic cation transporter 1 (rOCT1) relevant for transport
Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-65849
- Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das mechanistische Funktionsprinzip des Rat Organic Cation Transporter 1, stellvertretend für die Gruppe der organischen Kationentransporter, im Hinblick auf die Beteiligung einzelner Aminosäuren der mutmaßlichen Bindungstasche am Transportprozess (Tyr222, Asp475) untersucht. Hierbei stand insbesondere die Frage nach einer gleichzeitigen oder sequentiellen Interaktion der o. g. Aminosäuren mit dem jeweils gewählten Transportliganden im Vordergrund. Bei Mutation der untersuchten InteraktionsstellenIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das mechanistische Funktionsprinzip des Rat Organic Cation Transporter 1, stellvertretend für die Gruppe der organischen Kationentransporter, im Hinblick auf die Beteiligung einzelner Aminosäuren der mutmaßlichen Bindungstasche am Transportprozess (Tyr222, Asp475) untersucht. Hierbei stand insbesondere die Frage nach einer gleichzeitigen oder sequentiellen Interaktion der o. g. Aminosäuren mit dem jeweils gewählten Transportliganden im Vordergrund. Bei Mutation der untersuchten Interaktionsstellen (Einzelmutanten Y222F, D475E, Doppelmutante Y222F/D475E) konnten Km-Änderungen für die zelluläre Aufnahme von MPP und TEA sowie IC50-Änderungen für die Hemmung des MPP-Transportes durch TEA bzw. TBuA im Xenopus-laevis-Oozytenmodell mittels radioaktiver Aufnahmemessungen erzielt werden. Trotz eines signifikant additiven Effektes der Doppelmutation auf die TEA-Affinität des Transporters im Vergleich zu den Einzelmutanten erschien ein sequentieller Transportmechanismus aufgrund der nicht additiven IC50(TEA)-Verminderung für den MPP-Transport und der Sicherung der Lokalisation von Tyr222 und Asp475 auf unterschiedlichen Seiten der Plasmamembran durch TBuA-Inhibitionsversuche der MPP-Aufnahme wahrscheinlich. Gestützt wurden diese Ergebnisse durch die analoge Modellierung dreidimensionaler Darstellungen des doppelmutierten rOCT1(Y222F/D475E) anhand bereits kristallographisch vermessener Prokaryotentransporter. Diese Modelle bestätigten eine interaktionsrelevante räumliche Position der modifizierten Aminosäurereste innerhalb der Bindungstasche, welche eine metachrone Substrat- bzw. Inhibitorbindung nahelegte. Demnach interagiert in Kongruenz beider Untersuchungsansätze zunächst Tyr222 auf extrazellulärer Seite mit dem Liganden, während der intramembranären Konformationsänderung des Transporters erfolgt dann eine Transposition des Substrates respektive Inhibitors auf Asp475 auf der Zytosolseite.…
- The involvement of two amino acids (Y222, D475) of the innermost cavity of rat organic cation transporter 1 (rOCT1) in the transport process was investigated. The study aimed at characterizing the interaction between substrates and the amino acid residues as a synchronous or sequential process. Mutations of the above mentioned amino acids (Y222F, D475E, Y222F/D475E) showed a significantly additive effect on TEA affinity in contrast to MPP for the double mutant on one hand. On the other hand there was no additive decrease in IC50(TEA) values forThe involvement of two amino acids (Y222, D475) of the innermost cavity of rat organic cation transporter 1 (rOCT1) in the transport process was investigated. The study aimed at characterizing the interaction between substrates and the amino acid residues as a synchronous or sequential process. Mutations of the above mentioned amino acids (Y222F, D475E, Y222F/D475E) showed a significantly additive effect on TEA affinity in contrast to MPP for the double mutant on one hand. On the other hand there was no additive decrease in IC50(TEA) values for MPP transport. Additionally, the accessibility of Y222 and D475 on different sides of the plasma membrane during transport was verified by TBuA inhibition of MPP translocation. Taken together these findings strongly suggest a sequential transport mechanism. This interpretation of the experimental data was also supported by computer based three dimensional modelling of the Y222F/D475E double mutant with substrates/inhibitors bound to the innermost cavitiy, which showed the positions of the two amino acids within the tertiary structure of rOCT1 to be suitable for metachronous substrate interactions.…
Author: | Marcus Heinz Martin Leistner |
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URN: | urn:nbn:de:bvb:20-opus-65849 |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Granting Institution: | Universität Würzburg, Medizinische Fakultät |
Faculties: | Medizinische Fakultät / Institut für Anatomie und Zellbiologie |
Date of final exam: | 2011/10/20 |
Language: | German |
Year of Completion: | 2011 |
Dewey Decimal Classification: | 6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit |
GND Keyword: | Organischer Kationentransporter |
Tag: | Organic cation transporter |
Release Date: | 2011/10/28 |
Advisor: | Prof. Dr. Hermann Koepsell |
Licence (German): | Deutsches Urheberrecht |