Claudia Siverino

• In contrast to common bone fractures, critical size bone defects are unable to self-regenerate and therefore external sources for bone replacement are needed. Currently, the gold standard to treat critical size bone fractures, resulting from diseases, trauma or surgical interventions, is the use of autologous bone transplantation that is associated with several drawbacks such as postoperative pain, increased loss of blood during surgery and extended operative time. The field of bone tissue engineering focuses on the combination of biomaterialsIn contrast to common bone fractures, critical size bone defects are unable to self-regenerate and therefore external sources for bone replacement are needed. Currently, the gold standard to treat critical size bone fractures, resulting from diseases, trauma or surgical interventions, is the use of autologous bone transplantation that is associated with several drawbacks such as postoperative pain, increased loss of blood during surgery and extended operative time. The field of bone tissue engineering focuses on the combination of biomaterials and growth factors to circumvent these adverse events and thereby to improve critical size bone defects treatment. To this aim, a promising approach is represented by using a collagen sponge soaked with one of the most powerful osteoinductive proteins, the bone morphogenetic protein 2 (BMP2). After the approval by the Food and Drug Administration (FDA), BMP2 was used to successfully treat several severe bone defects. However, the use of BMP2 delivery systems is associated with severe side effects such as inflammation, swelling, ectopic bone formation outside of the site of implantation and breathing problems if implanted in the area of the cervical spine. The occurrence of severe side effects is related to the supraphysiological amounts of the applied protein at the implantation site. The BMP2 is typically adsorbed into the scaffold and diffuses rapidly after implantation. Therefore, intensive research has been conducted to improve the protein’s retention ability, since a prolonged entrapment of the BMP2 at the implantation site would induce superior bone formation in vivo due to a minimized protein release. By controlling the release from newly designed materials or changing the protein immobilization methods, it seems possible to improve the osteoinductive properties of the resulting BMP2-functionalized scaffolds. The combination of biocompatible and biodegradable scaffolds functionalized with a covalently immobilized protein such as BMP2 would constitute a new alternative in bone tissue engineering by eliminating the aforementioned severe side effects. One of the most common immobilization techniques is represented by the so-called EDC/NHS chemistry. This coupling technique allows covalent biding of the growth factor but in a non-site direct manner, thus producing an implant with uncontrollable and unpredictable osteogenic activities. Therefore, the generation of BMP2 variants harboring functional groups that allow a site-directed immobilization to the scaffold, would enable the production of implants with reproducible osteogenic activity. The new BMP2 variants harbor an artificial amino acid at a specific position of the mature polypeptide sequence. The presence of the unnatural amino acid allows to use particular covalent immobilization techniques in a highly specific and site directed manner. The two selected BMP2 variants, BMP2 E83Plk and BMP2 E83Azide, were expressed in E. coli, renatured and purified by cation exchange chromatography. The final products were intensively analyzed in terms of purity and biological activity in vitro. The two BMP2 variants enabled the application of different coupling techniques and verify the possible options for site directed immobilization to the scaffold. Intensive analyses on the possible side effects caused by the coupling reactions and on the quantification of the coupled protein were performed. Both click chemistry reactions showed high reaction efficacies when the BMP2 variants were coupled to functionalized fluorophores. Quantification by ELISA and scintillation counting of radioactively labeled protein revealed different outcomes. Moreover, the amounts of protein detected for the BMP2 variants coupled to microspheres were similar to that of the wild type protein. Therefore, it was not possible to conclude whether the BMP2 variants were covalently coupled or just adsorbed. BMP2 variants being immobilized to various microspheres induced osteogenic differentiation of C2C12 cells in vitro, but only in those cells that were located in close proximity to the functionalized beads. This selectivity strongly indicates that the protein is for a great portion covalently coupled and not just adsorbed. Moreover, the difference between the covalently coupled BMP2 variants and the adsorbed BMP2 WT was confirmed in vivo. Injection of the BMP2-functionalized microspheres in a rat model induced subcutaneous bone formation. The main aim of the animal experiment was to prove whether covalently coupled BMP2 induces bone formation at significant lower doses if compared to the amount being required if the protein is simply adsorbed. To this aim, several BMP2 concentrations were tested in this animal experiment. The BMP2 variants, being covalently immobilized, were hypothesized to be retained and therefore bio-available at the site of implantation for a prolonged time. However, in the animal experiments, lower doses of either coupled or adsorbed protein were unable to induce any bone formation within the 12 weeks. In contrast, the highest doses induced bone formation that was first detected at week 4. During the 12 weeks of the experiment, an increase in bone density and a steady state bone volume was observed. These results were obtained only for the covalently coupled BMP2 E83Azide but not for BMP2 E83Plk that did not induce bone formation in any condition. The negative outcome after application of BMP2 E83Plk suggested that the coupling reaction might have provoked changes in the protein structure that extremely influenced its osteogenic capabilities in vivo. However, the histological examination of the different ossicles induced either by BMP2 WT or BMP2 E83Azide, revealed clear morphological differences. BMP2 WT induced a bone shell-like structure, while the covalently coupled protein induced uniform bone formation also throughout the inner part. The differences between the two newly formed bones can be clearly associated with the different protein delivery mechanisms. Thus, the developed functionalized microspheres constitute a new interesting strategy that needs further investigations in order to be able to be used as replacement of the currently used BMP2 WT loaded medical devices.…
• Knochendefekte kritischer Größe sind im Vergleich zu normalen Knochenfrakturen nicht in der Lage selbst zu heilen. Daher werden zusätzlich Knochenersatzmaterialien zu deren Heilung benötigt. Der derzeitige Goldstandard in der Behandlung dieser Defekte, die durch Krankheiten, Traumata oder durch chirurgische Eingriffe hervorgerufen werden können, ist Transplantation autologen Knochens, was jedoch mit einigen Nachteilen verbunden ist. Als Alternative können neuartige biokompatible Materialien mit intrinsischem osteogenen Potential verwendetKnochendefekte kritischer Größe sind im Vergleich zu normalen Knochenfrakturen nicht in der Lage selbst zu heilen. Daher werden zusätzlich Knochenersatzmaterialien zu deren Heilung benötigt. Der derzeitige Goldstandard in der Behandlung dieser Defekte, die durch Krankheiten, Traumata oder durch chirurgische Eingriffe hervorgerufen werden können, ist Transplantation autologen Knochens, was jedoch mit einigen Nachteilen verbunden ist. Als Alternative können neuartige biokompatible Materialien mit intrinsischem osteogenen Potential verwendet werden. Solche Materialien können Wachstumsfaktoren beinhalten welche aktiv die Heilung des beschädigten Knochens fördern. Ein vielversprechender Ansatz um dieses Ziel zu erreichen, ist der Einsatz eines Kollagenträgers, welcher mit einem der stärksten osteoinduktiven Proteine, dem Bone Morphogenic Protein 2 (BMP2) dotiert ist. Nach der Genehmigung durch die Food and Drug Administration (FDA), wurde BMP2 erfolgreich bei der Behandlung von schwerwiegenden Knochendefekten eingesetzt. Daher wird es als bisher beste Alternative zu autologen Transplantaten sowie als beste Möglichkeit zur Anregung der Knochenneubildung angesehen. Nichtdestotrotz geht der Einsatz von mit BMP2 beladenen Trägersystemen mit Nebenwirkungen, wie Entzündungen Schwellungen, Knochenwucherungen abseits des behandelten Defektes sowie Atembeschwerden bei Behandlungen im Bereich der Halswirbelsäule einher. Die Nebenwirkungen werden durch die supraphysiologische Menge an Protein, mit der die Trägerstruktur beladen wird hervorgerufen. Jedoch ist solch eine Menge an Protein nötig, da die Abgabe des Proteins an der Transplantationsstelle sehr schnell abläuft. Deshalb konzentriert sich die Forschung auf die Verbesserung der Freisetzungskinetik, da ein längerer Verbleib des BMP2 an der Implantationsstelle sowie eine verringerte Freisetzung des Proteins eine bessere Knochenbildung in vivo herbeiführt. Die Freisetzungskinetik kann durch die Eigenschaften neu entwickelter Materialien selbst oder durch alternative Methoden der Kopplung des Proteins an die Trägerstruktur verändert werden. Die Kombination aus biokompatiblen sowie biodegradierbaren Trägerstrukturen, an die über kovalente Bindungen BMP2 gebunden wird, stellt eine vielversprechende Alternative dar, welche die vorgenannten Nebenwirkungen bei der Knochenregeneration eliminiert. Die am häufigsten eingesetzte Methode zur kovalenten Anbindung von Proteinen an Trägerstukturen erfolgt über die sogenannte EDC/NHS-Chemie. Diese Technik erlaubt die allerdings nur eine ungerichtete Anbindung wodurch die standardisierte Reproduktion eines möglichen Medizinproduktes erschwert wird. Als Resultat entstehen sehr wahrscheinlich Implantate mit unvorhersehbaren osteogenen Eigenschaften. Die Herstellung von BMP2-Varianten, welche gerichtet an Trägerstrukturen gekoppelt werden können, ermöglicht die Herstellung von Implantaten mit reproduzierbarer osteogener Aktivität. Alle hier vorgestellte Varianten beinhalten eine artifizielle Aminosäure an einer bestimmten Stelle in der Polypeptidsequenz. Die künstliche Aminosäure ermöglicht den Einsatz spezieller Kopplungschemien für kovalente Bindungen, welche dadurch per Definition spezifisch und gerichtet sind. Für weiterführende Experimente wurden die folgende BMP2-Varianten ausgewählt: BMP2 E83Plk und BMP2 E83Azide. Diese wurden durch Expression in E. coli gewonnen, renaturiert und mittels Ionenchromatographie aufgereinigt. Die gewonnenen Produkte wurden hinsichtlich ihrer Reinheit und biologischen Aktivität in vitro untersucht. Beide BMP2 Varianten ermöglichen den Einsatz verschiedener Kopplungstechniken an geeignete Trägerstrukturen. Analysen hinsichtlich möglicher Nebenwirkungen aufgrund der Kupplungsreaktion sowie die genaue Quantifizierung der gekoppelten Proteine auf den Mikrosphären wurden durchgeführt. Beide Kopplungsstrategien zeigten eine hohe Effizienz wobei für die Quantifizierung der Proteinmengen mittels ELISA und Szintillationszählung unterschiedliche Werte gemessen wurden. Des Weiteren war die gemessene Proteinmenge von an Mikrosphären gekoppelten BMP2 Varianten in einem ähnlichen Bereich, wie die bei der ungekoppelten BMP2 WT Kontrolle gemessen wurden. Daher war es nicht möglich zu bestimmen, inwieweit die verwendeten BMP2-Varianten kovalent gebunden oder lediglich adsorbiert waren. Die BMP2 Varianten, die anhand der verwendeten Kopplungschemie in kovalent gebundener Form vorliegenden sollten, induzierten unabhängig vom jeweils verwendeten Material der Sphären die osteogene Differenzierung von C2C12 Zellen die in unmittelbarem Kontakt zu diesen Sphären standen. Im Falle von BMP2 WT beinhaltenden Sphären wurde auch Zelldifferenzierung in Distanz zu den einzelnen Sphären beobachten, was auf Diffusionsprozesse hindeutet. Da dies im Falle der kovalent gekoppelten BMP-2 Varianten nicht beobachtet werden konnte zeigt, dass das Protein hier zum Großteil kovalent gebunden vorliegt und nicht nur adsorbiert wird. Unterschiede zwischen den kovalent gebundenen BMP2 Varianten und dem adsorbierten Wildtyp zeigten sich auch in den Tierexperimenten. Mikrosphären, welche mit BMP2 WT oder einem der beiden BMP2 Varianten beladenen waren, wurden einer Ratte subkutan injiziert, was zu einer ektopen Knochenbildung führte. Das Ziel des Tierversuches war, zu überprüfen, ob geringere Dosen an kovalent gebundenem BMP2, verglichen mit der hohen benötigten Menge an adsorbiertem Protein diese Knochenneubildung induzieren kann. Dabei wurden verschiedene BMP2 Konzentrationen getestet. Die Hypothese war, dass die kovalent gebundenen BMP2 Varianten zurückgehalten werden beziehungsweise langsamer freigesetzt werden und daher über einen längeren Zeitraum an der Implantationsstelle wirksam sind. Allerdings konnte im Tierversuch weder durch niedrig dosiertes (< 10 μg) kovalent gebundenes noch durch adsorbiertes Protein innerhalb von 12 Wochen ektope Knochenbildung induziert werden. Dagegen konnte mit der höchsten Dosis bereits nach 4 Wochen Knochenbildung nachgewiesen werden. Während des zwölfwöchigen Experiments konnte ein Anstieg der Knochendichte und ein Steady State des Knochenvolumens beobachtet werden. Dies traf jedoch nur für das kovalent gebundene BMP2 E83Azide zu, jedoch nicht für das BMP2 E83Plk, welches bei allen Dosen kein Knochenwachstum hervorrufen konnte. Das negative Ergebnis nach der Gabe von BMP2 E83Plk deutet darauf hin, dass die hier verwendete Kopplungschemie möglicherweise eine Veränderung der Proteinstruktur bewirkt und dadurch die biologische Aktivität des Proteins verloren geht. Allerdings zeigten histologische Untersuchungen der gebildeten Knochenstrukturen, welche durch BMP2 WT oder durch BMP2 E83Azide hervorgerufen wurden, deutliche morphologische Unterschiede. BMP2 WT erzeugt eine solide schalenförmige Strukturen während das kovalent gebundene Protein ein eher gleichförmiges Knochenwachstum induziert, auch im Inneren der gebildeten Knochenstruktur, welches hier Reste implantierten Mikrosphären umschließt. Dies konnte nicht in den durch BMP2 WT induzierten Knochenstrukturen nachgewiesen werden. Der Unterschied zwischen den zwei Formen neu gebildeten Knochens kann mit den verschiedenen Freisetzungsmechanismen in Verbindung gebracht werden. Daher stellt die Entwicklung funktionalisierter Mikrosphären eine neue interessante Strategie dar, welche weiterführende Untersuchungen benötigt, um die aktuell genutzten BMP2 WT beinhaltenden Medizinprodukte zu ersetzen.…