Christiane Albert-Weißenberger

• The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. PhenotypicThe bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.…
• Das pathogene Bakterium Legionella pneumophila repliziert sich in der Natur intrazellulär in Protozoen. Beim Menschen kann das Bakterium eine schwere Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit auslösen. Hierbei vermehren sich die Bakterien in Alveolarmakrophagen der Lunge. Der Lebenszyklus von L. pneumophila Bakterien ist gekennzeichnet durch zwei Phase: replikative Bakterien sind avirulent; im Gegensatz dazu sind transmissive Bakterien virulent und flagelliert. Hauptziel dieser Arbeit war es die Beteiligung der regulatorischen Proteins FleQ,Das pathogene Bakterium Legionella pneumophila repliziert sich in der Natur intrazellulär in Protozoen. Beim Menschen kann das Bakterium eine schwere Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit auslösen. Hierbei vermehren sich die Bakterien in Alveolarmakrophagen der Lunge. Der Lebenszyklus von L. pneumophila Bakterien ist gekennzeichnet durch zwei Phase: replikative Bakterien sind avirulent; im Gegensatz dazu sind transmissive Bakterien virulent und flagelliert. Hauptziel dieser Arbeit war es die Beteiligung der regulatorischen Proteins FleQ, FleR, and RpoN an der Flagellengenregulation zu ermitteln. Mutanten für die Gene welche für FleQ, FleR oder RpoN codieren exprimieren in der transmissiven Phase im Genesatz zum Wildtyp nur wenig Flagellin und sind nicht flagelliert. Nachgewiesen wurde dies durch eine phänotypische Analyse, Western blot und Ektronenmikroskopie. Studien des Transkripoms dieser Mutanten zeigten, daß FleQ die Expression zahlreicher Flagellenbiosynthesegenen kontrolliert. Gemeinsam mit RpoN kontrolliert FleQ die Transkription von 14 der 31 Klasse II Flagellengene, welche für Basalkörper, Haken und regulatorische Proteine codieren. Überraschenderweise sind 7 der 15 späten Flagellengenen (Klasse III und IV) abhängig von FleQ, aber unabhängig von RpoN exprimiert. Daher und entgegen der allgemeinen Auffassung dass sogenannte ‚enhancer binding' Proteine wie FleQ zur Transkriptionsinitiation immer mit RpoN interagieren, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass FleQ von L. pneumophila Genexpression sowohl RpoN-abhängig, als auch RpoN-unabhängig reguliert. Ebenso anders als zuvor vorgeschlagen, verdeutlichen Studien des Transkriptoms einer fleR Mutante, dass FleR nicht die Expression der Klasse III Flagellengene induziert. Statt dessen reguliert FleR gemeinsam mit RpoN zahlreiche Gene der Proteinbiosynthese und des Metabolismus. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen sind in unserem modifizierten Modell für die transkriptionelle Regulation der L. pneumophila Flagellengene die Flagellengene der Klasse II von FleQ und RpoN kontrolliert, während die Flagellengene der Klasse III und IV in einer fleQ-abhängigen aber rpoN-unabhängigen Weise kontrolliert sind. Obwohl alle L. pneumophila Stämme den zweiphasigen Lebenszyklus aufweisen haben sich unterschiedliche Pathotypen evolviert. Das ist auch in den Genomen sichtbar, die z. B. genomische Inseln enthalten. Die genomische Insel Trb-1 von L. pneumophila Corby trägt alle Gene eines Typ-IV Konjugationssystem, ein ntegrase-Gen und einen putative oriT-Bereich. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es also zu untersuchen, inwieweit Trb-1 an konjugativem DNA-Transfer beteiligt ist. Mit Hilfe von Konjugationsexperimenten, zeigten wir, dass der oriT-Bereich von Trb-1 funktional ist und zur Konjugation zwischen verschiedenen L. pneumophila Stämmen beiträgt. Dies ist der erste oriT Bereich von L. pneumophila, dessen Funktionalität nachgewiesen wurde. Damit bekräftigen unsere Ergebnisse, dass Konjugation eine treibende Kraft für die Evolution neuer Pathotypen in L. pneumophila ist.…