Sebastian Frischholz

• Articular cartilage is an exceptional connective tissue which by a network of fibrillar collagen and glycosaminoglycan (GAG) molecules allows both low- friction articulation and distribution of loads to the subchondral bone (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Because of its very limited ability to self-repair, chondral defects following traumatic injury increase the risk for secondary osteoarthritis (OA) (Muthuri et al., 2011). Still, current OA treatments such as common nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and jointArticular cartilage is an exceptional connective tissue which by a network of fibrillar collagen and glycosaminoglycan (GAG) molecules allows both low- friction articulation and distribution of loads to the subchondral bone (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Because of its very limited ability to self-repair, chondral defects following traumatic injury increase the risk for secondary osteoarthritis (OA) (Muthuri et al., 2011). Still, current OA treatments such as common nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and joint replacement primarily address end-stage symptoms (Tonge et al., 2014). As low-grade inflammation plays a pivotal role in the pathogenesis of OA (Robinson et al., 2016), there is a strong demand for novel therapeutic concepts, such as integrating application of anti-inflammatory agents into cartilage cell- based therapies in order to effectively treat OA affected joints in early disease stages. The polyphenolic phytoalexin resveratrol (RSV), found in the skin of red grapes, berries, and peanuts, has been shown to have effective anti-inflammatory properties (Shen et al., 2012). However, its long-term effects on 3D chondrocyte constructs cultured in an inflammatory environment with regard to tissue quality have remained unexplored so far. Therefore, in this study, pellets made from expanded porcine articular chondrocytes were cultured for 14 days with either the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) or RSV (50 μM) alone, or a co-treatment with both agents. Constructs treated with chondrocyte medium only served as control. Treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a significantly smaller pellet size and reduced DNA content. However, RSV counteracted the IL-1β-induced decrease and significantly enhanced diameter and DNA content. Also, in terms of GAG deposition, treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a tremendous depletion of absolute GAG content and GAG/DNA. Again, RSV co-treatment counteracted the inflammatory stimulus and led to a partial recovery of GAG content. Histological analysis utilizing safranin-O staining confirmed these findings. Marked expression of the cartilage-degrading enzyme matrix metalloproteinase 13 (MMP13) was detected in IL-1β-treated pellets, but none upon RSV co- treatment. Moreover, co-treatment of IL-1β-challenged constructs with RSV significantly increased absolute collagen content. However, under non- inflammatory conditions, RSV induced gene expression and protein accumulation of collagen type X, a marker for undesirable hypertrophy. Taken together, in the present thesis, RSV was demonstrated to elicit marked beneficial effects on the extracellular matrix composition of 3D cartilaginous constructs in long-term inflammatory culture in vitro, but also induced hypertrophy under non-inflammatory conditions. Based on these findings, further experiments examining multiple concentrations of RSV under various inflammatory conditions appear desirable concerning potential therapeutic applicability in OA.…
• Gelenkknorpel ermöglicht als spezielles Bindegewebe aus Kollagenfasern und Glykosaminoglykanen (GAG) sowohl die reibungsarme Beweglichkeit in Gelenken als auch die Lastübertragung auf angrenzende Knochen (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Aufgrund der sehr begrenzten Fähigkeit zur intrinsischen Erneuerung erhöhen chondrale Defekte nach traumatischen Verletzungen das Risiko für sekundäre Arthrose (Osteoarthritis; OA) (Muthuri et al., 2011). Dennoch konzentrieren sich derzeitige Behandlungsansätze, einschließlichGelenkknorpel ermöglicht als spezielles Bindegewebe aus Kollagenfasern und Glykosaminoglykanen (GAG) sowohl die reibungsarme Beweglichkeit in Gelenken als auch die Lastübertragung auf angrenzende Knochen (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Aufgrund der sehr begrenzten Fähigkeit zur intrinsischen Erneuerung erhöhen chondrale Defekte nach traumatischen Verletzungen das Risiko für sekundäre Arthrose (Osteoarthritis; OA) (Muthuri et al., 2011). Dennoch konzentrieren sich derzeitige Behandlungsansätze, einschließlich nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAR) und des operativen Gelenkersatzes, hauptsächlich auf Symptome im Endstadium der Erkrankung (Tonge et al., 2014). Da eine geringgradige Entzündung eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Arthrose spielt (Robinson et al., 2016), besteht ein starker Bedarf an neuartigen Therapiekonzepten, wie der Kombination von anti- inflammatorischen Wirkstoffen mit knorpelzellbasierten Therapien, um von Arthrose betroffene Gelenke in frühen Krankheitsstadien wirksam zu behandeln. Das polyphenolische Phytoalexin Resveratrol (RSV), welches in der Schale roter Weintrauben, in Beeren und Erdnüssen vorkommt, besitzt starke entzündungshemmende Eigenschaften (Shen et al., 2012). Langzeiteffekte auf 3D-Knorpelkonstrukte unter inflammatorischen Bedingungen sind hinsichtlich der Gewebequalität jedoch bislang unerforscht geblieben. Daher wurden in der vorliegenden Studie Pellets aus expandierten porcinen Gelenkknorpelzellen über einen Zeitraum von 14 Tagen entweder mit dem pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) oder RSV (50 μM) allein, oder mit beiden Agenzien kombiniert behandelt. Konstrukte, welche nur serumfreies Chondrozytenmedium erhielten, dienten als Kontrolle. Die Behandlung mit IL- 1β in einer Konzentration von 10 ng/ml führte zu einem signifikant geringeren Durchmesser der Pellets sowie einem verringerten DNA-Gehalt. RSV wirkte dieser IL-1β-vermittelten Reduktion entgegen und steigerte signifikant sowohl Durchmesser als auch DNA-Gehalt der untersuchten Konstrukte. Auch in Bezug auf die Deposition von GAG-Molekülen führte die Kultur mit IL-1β (10 ng/ml) zu einer massiven Abnahme des absoluten GAG-Gehaltes und der GAG/DNA- Ratio. Abermals wirkte die gleichzeitige Behandlung mit RSV dem Entzündungsreiz deutlich entgegen und resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des GAG-Gehaltes. Die histologische Analyse unter Verwendung von Safranin-O-Färbungen bestätigte diese Ergebnisse. Darüber hinaus manifestierte sich eine ausgeprägte Expression des knorpelabbauenden Enzyms Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) in IL-1β behandelten Pellets, nicht jedoch in denen, die simultan mit RSV behandelt wurden. Außerdem resultierte die gleichzeitige Behandlung von IL-1β-stimulierten Konstrukten mit RSV in einer signifikanten Erhöhung des absoluten Kollagengehaltes. Unter nicht-inflammatorischen Bedingungen induzierte RSV die Genexpression und Proteinakkumulation von Kollagen Typ X, einem Marker für unerwünschte Hypertrophie. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass RSV deutliche positive Effekte auf die Extrazellulärmatrix von 3D- Knorpelkonstrukten in einer Langzeit-Entzündungskultur in vitro hervorruft, allerdings unter nicht-inflammatorischen Bedingungen Hypertrophie induziert. Basierend auf diesen Befunden erscheinen weitere Experimente zur Untersuchung unterschiedlicher RSV-Konzentrationen unter verschiedenen Entzündungsbedingungen hinsichtlich einer möglichen therapeutischen Anwendbarkeit bei OA wünschenswert.…