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Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen.
In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven.
FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst.
Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität.
Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen.
Einleitung:
TRPC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle in der Pathologie der Herzinsuffizienz und kardialen Hypertrophie. Diese Effekte werden unter anderem über den Calcineurin-NFAT-Signalweg vermittelt. Ein wichtiger Interaktionspartner und Regulator von TRPC-Kanälen ist das Protein FKBP52. Mittels eines Yeast Two-Hybrid Systems wurde in einer kardialen cDNA library eine Interaktion zwischen einem C-terminalen Fragment von TRPC3 (AS 742-848), welches außerhalb der bekannten FKBP-Bindungsdomäne (AS 703-714) liegt, und FKBP52 beobachtet. Da dies eine weitere Bindungsstelle in FKBP52 vermuten ließ, erzeugten wir ein Fragment von FKBP52, welches FKBP52s genannt wurde und dem die funktionell relevante PPIase I-Domäne mit der bekannten Bindungsstelle fehlt. Eine erste Co-IP zwischen diesem Fragment und TRPC3 war erfolgreich.
Ziel:
Die Bestimmung, ob die Anwesenheit des verkürzten FKBP52 in vivo die Komplexbildung aus TRPC3 bzw. TRPC4 und dem Wildtyp-FKBP52 unterdrückt. Zusätzlich, ob FKBP52s die Interaktion zwischen TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin in vivo unterbricht und damit die Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges hemmt.
Methoden:
Co-Immunopräzipitationen (Co-IP) wurden mit HEK-293-Zellen durchgeführt, die mit cDNA transfiziert wurden, welche Gene für TRPC3, TRPC4, Calcineurin A und FKBP52s enthielt. Zur Bestimmung der nukleären Translokation von NFATc1 mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden HEK-293-Zellen mit TRPC3, TRPC4, GFP-NFATc1 ± FKBP52s transfiziert. Die statistische Analyse erfolgte mit einer One-Way ANOVA.
Ergebnisse:
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FKBP52 sowohl mit TRPC3 als auch mit TRPC4 interagiert. Ebenso wurde festgestellt, dass FKBP52 auch ohne seine katalytische PPIase I-Domäne Bindungen mit TRPC3 bzw. TRPC4 eingeht. Dieses FKBP52-Konstrukt nimmt ebenso an der Komplexbildung mit TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin teil. Des Weiteren ließ sich für TRPC3 zeigen, dass unter Stimulation mit Carbachol (GPCR-Agonist) bei Anwesenheit dieses gekürzten FKBP52 eine signifikant geringere Aktivierung und Wanderung des Transkriptionsfaktors NFAT in den Nucleus erfolgte.
Schlussfolgerung:
FKBP52 spielt daher eine wichtige Rolle in dieser Signalkaskade, indem es entscheidend an der Aktivierung von Calcineurin und dessen Rekrutierung zum TRPC-Kanalkomplex beteiligt ist und damit auch an der Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges.