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In klinischen Studien wurden bereits positive Effekte des standardisierten Kiefernrindenextrakts Pycnogenol® auf die Symptome von Patienten mit milden Formen von Kniegelenks-Osteoarthritis ermittelt; hauptsächlich ausgedrückt durch Senkung des WOMAC-Scores. Der hinter dieser Symptomverbesserung zu Grunde liegende Mechanismus wurde jedoch noch nicht untersucht. Deshalb sollten in der vorliegenden Arbeit erstmalig die zellulären pharmakodynamischen Effekte des Nahrungsergänzungsmittels, in Hinblick auf wichtige Marker der Knorpelhomöostase, untersucht werden. Hierfür wurden 30 Patienten mit schweren Gonarthrose-Formen und Indikation zum Kniegelenksersatz in eine randomisiert-kontrollierte Studie eingeschlossen.
Die genaue Ursache der Erkrankung Osteoarthritis ist bis heute nicht geklärt, jedoch gilt ein Ungleichgewicht von Knorpelaufbau und –abbau in den betroffenen Gelenken als einer der zentralen Parameter der Pathogenese. Diese Imbalance resultiert in einem sukzessiven Knorpelverlust, der mit einem Entzündungsgeschehen im ganzen Gelenk, also auch unter Beteiligung von Synovium und subchondralen Knochen, einhergeht. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die matrix-abbauenden Enzyme MMPs und ADAMTS sowie proinflammatorische Mediatoren, z.B. das IL-1β. Nach dreiwöchiger Einnahme von 200 mg Pycnogenol® am Tag, konnten wir, im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, eine Senkung der relativen Genexpression von MMP-1, MMP-3 und MMP-13 im Knorpelgewebe feststellen. Bei MMP-3 und MMP 13 war diese Reduktion signifikant. Ebenso wurde die relative Expression von IL-1β statistisch signifikant gesenkt. Im Rahmen der Untersuchung der Entwicklung von Markerkonzentrationen im Serum im Verlauf der Studie wurde eine signifikante Senkung der ADAMTS-5-Konzentrationen bei behandelten Patienten, im Vergleich zur Kontrollgruppe, offenbar. Weiterhin wurden die MMP-13-Konzentrationen im Serum positiv durch Einnahme des Rindenextraktes beeinflusst. In der Körperflüssigkeit, die dem Erkrankungsgeschehen am nähesten kommt, der Synovialflüssigkeit, konnten ebenso hemmende Effekte auf knorpelabbauende Enzyme nach Einnahme von Pycnogenol® beobachtet werden. Hierbei sah man niedrigere Konzentrationen der Marker MMP-1 und MMP-13 sowie der Abbaumarker von Typ-II-Collagen und von Aggrecan in den Gelenkflüssigkeiten der Verum- im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe. Im Rahmen von ex-vivo-Versuchen zeigten sich mit beiden Spezimen keine Unterschiede zwischen den beiden Studiengruppen. Die beobachteten Tendenzen konnten durch Korrelationsanalysen untermauert werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern den ersten Ansatz zum Verständnis der zellulären Mechanismen, die für die positiven Einflüsse des standardisierten Kiefernrindenextraktes auf die Symptomatik der Gonarthrose verantwortlich sind. Weitere Studien mit einer größeren Studienpopulation und einer Anwendung von Pycnogenol® über einen längeren Zeitraum sind nötig, um diese zellulären Geschehnisse zu bestätigen und näher zu untersuchen. Auf Grund des günstigen Nebenwirkungsprofils von Pycnogenol® ist eine Langzeittherapie zur Verzögerung eines erstmaligen Kniegelenksersatzes durchaus denkbar. Dies hätte den Vorteil, dass das betroffene Gelenk weniger oft ausgetauscht werden müsste, was wegen der begrenzten Haltbarkeit in etwa alle 10 Jahre geschieht.
Aus epidemiologischen Studien ist schon seit Längerem bekannt, dass eine hohe tägliche Aufnahme von Polyphenolen über die Nahrung zu geringeren Inzidenzraten neurologischer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer, führt. Auch Pycnogenol® hat in-vivo schon positive Effekte auf diverse neurologische Erkrankungsgeschehen gezeigt. Um zu verstehen, welcher Inhaltsstoff bzw. welche Inhaltsstoffe und/oder Metabolite die Blut-Hirn-Schranke passieren und für diese Wirkungen verantwortlich sein könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe eines cEND-in-vitro-Modells die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Bestandteile des Extraktes und des Metaboliten M1 untersucht. Dabei zeigte keine der untersuchten Substanzen unter den gewählten Versuchsbedingungen einen quantifizierbaren Übertritt durch den Zellkultur-Monolayer. Auf Grund unserer Versuche ist jedoch eine Aufnahme des M1 und von (+)-Catechin in die Endothelzellen durchaus denkbar. Diese Aufnahme scheint für den M1, in erleichterter Form, durch den GLUT-1-Transporter zu verlaufen.
Die positiven Effekte des Nahrungsergänzungsmittels auf neurologische Erkrankungen scheinen nicht durch direkte Einwirkungen im Gehirn selbst verursacht zu werden. Eine stabilisierende Wirkung auf die BHS, die eine wichtige Barriere zum Schutz des Gehirns vor äußeren Einflüssen ist, scheint dafür eine plausiblere Erklärung zu sein. Weiterführende in-vivo-Tierversuche können darüber Aufschluss geben.
Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der zellulären Effekte des standardisierten Kiefernrindenextraktes bei schwerer Kniegelenks-Osteoarthritis geleistet werden. Zusätzlich konnten wir, mit Hilfe eines rationalen Ansatzes zur Ermittlung der Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Inhaltsstoffe von Pycnogenol®, das Verständnis für die positiven Wirkungen von Pycnogenol® im Rahmen neurologischer Erkrankungen erweitern.
Ziel dieser Arbeit war es die intranasalen pharmakokinetischen Abläufe nach topischer Applikation mittels in vitro und ex vivo Experimenten zu charakterisieren und ihre Auswirkungen auf die Pharmakodynamik zu beschreiben. Es wurden hierbei die nasal angewendeten Glucocorticoide Triamcinolonacetonid (TCA), Budesonid (Bud), Beclomethasondipropionat (BDP), Fluticasonpropionat (FP), Mometasonfuroat (MF) und Fluticasonfuroat (FF) sowie ihre handelsüblichen Präparate Nasacort® (TCA), Budes® (Bud), ratioAllerg® (BDP), Flutide® Nasal (FP), Nasonex® (MF) und Avamys® (FF) untersucht. Zum Aufbringen der Wirkstoffsuspension auf die nasale Mukosa durch den Patienten kommen Dosierpumpsprays zum Einsatz, deren Dosiervorrichtung das Applikationsvolumen festlegen. Die Bestimmung des Sprühstoßvolumens unterschiedlicher handelsüblicher Präparate ergab Werte zwischen 56 und 147 µL/Sprühstoß. Zum ersten Mal wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglichte die Glucocorticoidkonzentration in den wässrigen Überständen handelsüblicher Präparate zu bestimmen. Die Wasserlöslichkeit der unterschiedlichen Glucocorticoide sowie die galenische Zusammensetzung der Formulierungen konnten als mögliche Einflussfaktoren für den bereits gelösten Wirkstoffanteil ermittelt werden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Löslichkeit der Wirkstoffkristalle der lipophileren Substanzen wie BDP, FP, MF und FF durch das KNS signifikant verbessert wurde. Die Löslichkeit der hydrophileren Wirkstoffe wie TCA und Bud wurde durch das KNS dagegen nur leicht beeinflusst. Nach der Auflösung der Wirkstoffkristalle können die gelösten Moleküle zur cytoplasmatischen Zielstruktur, dem Glucocorticoidrezeptor diffundieren und spezifisch binden. Neben der Rezeptorbindung erfolgt auch eine unspezifische Bindung an Nasengewebe. So wurde zunächst mit einem einfachen, bereits etablierten Versuchsaufbau erstmalig die Bindung von FF an Nasengewebe im Vergleich zu anderen Glucocorticoiden in vitro untersucht. Die lipophileren Substanzen wie FF, MF und FP grenzten sich hierbei durch eine höhere Gewebebindung von den hydrophileren TCA und Bud ab. Es wurde ein neues Modell entwickelt, welches die pharmakokinetische Untersuchung zur Gewebebindung mit der Pharmakodynamik der Wirkstoffe in Form ihres antiinflammatorischen Effektes im Zellkulturmodell verknüpfen sollte. So wurde wirkstoffgesättigtes Gewebe einer extensiven Auswaschphase in Humanplasma ausgesetzt, um es anschließend mit humanen Lungenepithelzellen zu inkubieren. Es konnte gezeigt werden, dass alle Gewebeproben den Wirkstoff in das Zellkulturmedium freisetzten, was eine Hemmung der IL-8 Sekretion aus Lungenepithelzellen zur Folge hatte. Die Stärke des antiinflammatorischen Effektes der IL-8 Hemmung durch FF, FP, Bud und TCA entsprach der Kombination aus Geweberetention und intrinsischer Aktivität (Rezeptoraffinität) der Wirkstoffe. Gewebeproben des MF führten zur geringsten IL-8 Hemmung, was durch die chemische Instabilität der Substanz erklärt werden konnte. Um eine weitere Annäherung an physiologische Verhältnisse zu erreichen, wurde erfolgreich ein Modell entwickelt, welches nach Applikation der Suspension auf die Mukosa die pharmakokinetischen Abläufe simulieren sollte. Dafür entscheidend war die Einbettung respiratorischen Gewebes in eine Gel-Matrix, wodurch eine zusammenhängende Mukosa-ähnliche Oberfläche erreicht werden konnte. Als Modellsubstanzen wurden Bud aus Budes®-Nasenspray und FP aus Flutide® Nasal sowie als Vertreter der Antihistaminika Azelastin-HCl (AZ-HCl) aus Vividrin® akut eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Gewebebindung des AZ-HCl im Vergleich zu den Glucocorticoiden am höchsten war. Die gute Korrelation der Gewebebindung der Substanzen mit ihrem Verteilungsvolumen und der Vergleich von FP mit Bud zeigte die erfolgreiche Etablierung des Modells. Beide Glucocorticoide zeigten nach Applikation der Wirkstoffsuspension zunächst eine ähnliche Assoziation an das Gewebe. Bei der Inkubation der Gewebe-Gel-Matrix mit Humanplasma wurde schließlich Fluticasonpropionat aus der Gewebe-Gel-Bindung im Vergleich zu Budesonid langsam freigesetzt. Weiterhin wurde im Gewebe-Gel-Modell die Bedeutung der Pharmakokinetik der Wirkstoffe auf die Pharmakodynamik ermittelt. Es wurden Freisetzungsproben der Gewebe-Gel-Matrices von AZ-HCl und FP auf ihre antiinflammatorische Aktivität untersucht. Die deutlich höhere Bindung des AZ-HCl an die Gewebe-Gel-Matrix äußerte sich auch in höheren Plasmakonzentrationen bei der Freisetzung im Vergleich zu FP. Jedoch konnte im Zellkulturmodell gezeigt werden, dass die Hemmung der IL-8 Freisetzung des FP, trotz der geringeren Konzentration in der Freisetzungsmatrix, das antiinflammatorische Potential des AZ-HCl übertraf.
Pharmakokinetische und molekularpharmakodynamische Aspekte inhalativ angewandter Glucocorticoide
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurden vielfältige pharmakokinetische bzw. molekularpharmakodynamische Aspekte topisch angewandter Glucocorticoide untersucht und deren klinische Relevanz diskutiert. Um die Potenz der Glucocorticoide vergleichen zu können, wurden deren relative Rezeptoraffinitäten zum humanen Glucocorticoidrezeptor mit Dexamethason als Referenzsubstanz bestimmt. Dabei zeigte sich, dass Glucocorticoide der neueren Generation wie Mometasonfuroat und Fluticasonpropionat sich in ihrer Assoziationskinetik unterschieden, während die Dissoziationskinetik vergleichbar war. Damit wurde erstmals für Mometasonfuroat eine relative Rezeptoraffinität berechnet, die einen unmittelbaren Vergleich mit weiteren in der Literatur publizierten Daten anderer Glucocorticoide erlaubte. Diese relative Rezeptoraffinität ist die höchste aller soweit bekannten inhalativen Glucocorticoide. In Kompetitionsversuchen wurde erstmals gezeigt, dass die in vitro nachgewiesenen Metabolite des Mometasonfuroats eine signifikante Rezeptoraffinität aufwiesen. Die Potenz dieser Metabolite ist dabei vergleichbar mit der von anderen inhalativ angewandten Corticosteroiden, wie Flunisolid und Triamcinolonacetonid. Mometasonfuroat konnte damit als das einzige inhalative Glucocorticoid charakterisiert werden, dessen Metabolite affiner als Dexamethason sind. Weiterführend zu den Erkenntnissen zur Rezeptorkinetik des Mometasonfuroats und Fluticasonpropionats wurde erstmals die vergleichende Kinetik der mRNA-Induktion auf zellulärer Ebene untersucht. Diese wurde am Beispiel des Glucocorticoid-regulierten CD163 in humanen Monocyten verfolgt. Es wurde eine Methode adaptiert, die schließlich eine Quantifizierung der CD163-mRNA mittels Real-time-PCR ermöglichte. Es zeigte sich, dass die Anzahl der neu gebildeten mRNA-Kopien direkt von der Rezeptoraffinität und der Konzentration des Mometasonfuroats und Fluticasonpropionats abhängig war. Die unterschiedliche Assoziationsgeschwindigkeit der beiden Glucocorticoide spiegelte sich jedoch nicht in einer schnelleren Induktion der CD163-mRNA wider. Neben der spezifischen Rezeptorbindung werden Glucocorticoide auch unspezifisch an Gewebe gebunden. Es wurden erstmals umfassende In-vitro-Versuche zur Bindung des Mometasonfuroats, Ciclesonids und seines aktiven Metaboliten an humanes Lungengewebe durchgeführt. Die Adsorption der Glucocorticoide an humanes Lungengewebe verlief schnell und war vergleichbar hoch. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den Substanzen beruhten dabei auf den nach Equilibrierung mit Plasma im Gewebe verbleibenden Konzentrationen. Es stellte sich heraus, dass Mometasonfuroat im Vergleich zu Fluticasonpropionat, Ciclesonid und dessen aktivem Metabolit Desisobutyryl-Ciclesonid die niedrigste Gewebeaffinität aufwies (Fluticasonpropionat > Ciclesonid > Desisobutyryl-Ciclesonid > Mometasonfuroat). Es konnte eine gute Übereinstimmung der in vitro Bindungsverhältnisse an Lungengewebe mit klinischen In-vivo-Daten aufgezeigt werden. Aus den zuvor in der Literatur beschriebenen Untersuchungen ließen sich zwar Hinweise auf die hepatische Metabolisierung des Mometasonfuroats entnehmen, doch Ergebnisse einer möglichen Metabolisierung bzw. der Stabilität in humanem Spezimen von therapeutischer Relevanz lagen soweit nicht vor. Somit wurde die Stabilität dieses Glucocorticoids im humanen Lungengewebe und Plasma systematisch untersucht. Dabei wurde eine unbekannte Substanz detektiert, die mittels HPLC-MS/MS, 1H- und 13C-NMR eindeutig als das 9,11-Epoxid des Mometasonfuroats identifiziert wurde. Kompetitionsversuche am humanen Glucocorticoidrezeptor zeigten, dass die relative Rezeptoraffinität des 9,11-Epoxy-Mometasonfuroats hoch war und wiederum vergleichbar mit der Bindungsaffinität des Triamcinolonacetonid oder Flunisolid. Das Auflösungsverhalten inhalativ angewandter Glucocorticoide in Bronchialflüssigkeit spielt eine entscheidende Rolle für deren weitere Verteilungskinetik und Wirkungen. Es wurde erstmals eine Methode entwickelt, mit der neben Morphologie und Größe der Partikel aus kommerziell erhältlichen Arzneiformen auch das Auflösungsverhalten in Bronchialsekret untersucht werden konnte. Durch den Einsatz der Raster-Elektronen-Mikroskopie wurde eine maximale Sensitivität zur Beobachtung der Partikelveränderungen bis zu einer Größe von 0,5 µm gewährleistet. Am Beispiel des Beclomethasondipropionats wurde gezeigt, dass die Arzneistoffpartikel aus verschiedenen Dosieraerosolen nach einer raschen Auflösung rekristallisieren. Erst diese Rekristallisation ist offenbar die Grundlage für eine nachfolgende langsame Auflösung und Umverteilung des Arzneistoffs ins Plasmakompartiment. Da diese neuartigen Beobachtungen in vollkommener Übereinstimmung mit pharmakokinetischen Daten nach Inhalation dieses Glucocorticoids stehen, darf angenommen werden, dass sich vergleichbare Vorgänge in vivo abspielen.