Filtern
Volltext vorhanden
- ja (3)
Gehört zur Bibliographie
- ja (3)
Dokumenttyp
- Dissertation (3) (entfernen)
Sprache
- Deutsch (3) (entfernen)
Schlagworte
- Pyridoxalphosphat (3) (entfernen)
Institut
Die Pyridoxal-5‘-Phosphat Phosphatase (PDXP), auch bekannt als Chronophin (CIN), ist eine HAD-Phosphatase, die beim Menschen ubiquitär exprimiert wird und eine entscheidende Rolle im zellulären Vitamin-B6-Metabolismus einnimmt. PDXP ist in der Lage Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), die co-enzymatisch aktive Form von Vitamin B6, zu dephosphorylieren. In-vivo Studien mit Mäusen zeigten, dass die Abwesenheit von PDXP mit verbesserten kognitiven Leistungen und einem verringerten Wachstum von Hirntumoren assoziiert ist. Dies begründet die gezielte Suche nach einem pharmakologischen Inhibitor für PDXP. Ein Hochdurchsatz-Screen legte nahe, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) hierfür ein potenzieller Kandidat ist. Zahlreiche Studien beschreiben bereits vielfältige positive neurologische Effekte nach in-vivo Administration von 7,8-DHF, allerdings bleibt der genaue Wirkmechanismus umstritten und wird bis dato nicht mit PDXP in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Inhibition von PDXP durch 7,8-DHF näher zu charakterisieren und damit einen Beitrag zur Beantwortung der Frage zu leisten, ob PDXP an den 7,8-DHF-induzierten Effekten beteiligt ist.
Hierzu wurde der Effekt von 7,8-DHF auf die enzymatische Aktivität von rekombinant hergestelltem, gereinigtem PDXP in in-vitro Phosphatase-Assays charakterisiert. Um die Selektivität von 7,8-DHF gegenüber PDXP zu untersuchen, wurden fünf weitere HAD-Phosphatasen getestet. Unter den analysierten Phosphatasen zeigte einzig die dem PDXP nah verwandte Phosphoglykolat Phosphatase (PGP) eine geringer ausgeprägte Sensitivität gegen 7,8-DHF. Ein Vergleich von 7,8-DHF mit sechs strukturell verwandten, hydroxylierten Flavonen zeigte, dass 7,8-DHF unter den getesteten Substanzen die höchste Potenz und Effektivität aufwies. Außerdem wurde eine Co-Kristallisation von PDXP mit 7,8-DHF durchgeführt, deren Struktur bis zu einer Auflösung von 2,0 Å verfeinert werden konnte. Die in der Kristallstruktur identifizierte Bindungsstelle von 7,8-DHF an PDXP wurde mittels verschiedener, neu generierter PDXP-Mutanten enzymkinetisch bestätigt. Zusammenfassend zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass 7,8-DHF ein direkter, selektiver und vorwiegend kompetitiver Inhibitor der PDXP-Aktivität ist, mit einer IC50 im submikromolaren Bereich.
Die Ergebnisse dieser in-vitro Untersuchungen motivieren zu weiterer Forschung bezüglich der 7,8-DHF-vermittelten Inhibition der PDXP-Aktivität in Zellen, um die Frage beantworten zu können, ob PDXP auch in-vivo ein relevantes Target für 7,8-DHF darstellt.
Die Phosphatase PDXP (auch bekannt als Chronophin) gehört zur Familie der HAD Phosphatasen, einer ubiquitär exprimierten Enzymklasse mit wichtigen physiologischen Funktionen. PDXP zeigt Phosphatase-Aktivität gegenüber seinem Substrat Pyridoxal 5´-Phosphat (PLP), der aktivierten Form von Vitamin B6. PDXP-defiziente Mäuse (Knockout-Mäuse) weisen im Vergleich zu Wildtypen verdoppelte PLP-Konzentrationen in Erythrozyten sowie im Gesamthirn auf. Vermutlich kommt PDXP daher eine wichtige Funktion in Erythrozyten und im Hirn zu. Ziel dieser Arbeit war es, erste Einblicke in diese Funktion(en) von PDXP zu erlangen.
Hierzu wurden HPLC-basierte Analysen der erythrozytären PLP-Konzentrationen in Wildtyp- sowie PDXP-defizienten Mäusen durchgeführt. Dabei ließen sich die rund doppelt so hohen erythrozytären PLP-Level in den KO-Mäusen bestätigen. Zudem ist es gelungen, eine Methode zur Messung der endogenen Phosphatase-Aktivität von PDXP in Erythrozytenlysaten zu etablieren. So konnte im Wildtyp anhand der Verringerung der PLP-Konzentrationen pro Zeiteinheit eine erythrozytäre PDXP-Aktivität nachgewiesen werden. Dazu waren die Inkubation mit Pyridoxin, sowie die Anwendung eines Inhibitors der PDXK notwendig. Eine bis dato vermutete Funktion der PDXP, zur Mobilisation von erythrozytärem PLP während Fastenzeiten, konnte ausgeschlossen werden. So zeigte der Vergleich der erythrozytären PLP-Konzentrationen aus gefasteten mit normal gefütterten Tieren in beiden Genotypen exakt dieselbe prozentuale PLP-Verringerung. Während Nahrungszufuhr ließ sich jedoch eine Funktion der Phosphatase PDXP als „Converter“ von Pyridoxin zu Pyridoxal erkennen. Ausgehend von PN konnte im Wildtyp (über die Zwischenprodukte PNP und PLP) eine PDXP-abhängige Dephosphorylierung von PLP zu PL erfolgen. So wies der Wildtyp eine rund vierfach höhere PL-Produktion auf, verglichen mit der PDXP-defizienten Maus. Die Phosphatase PDXP erwies sich als essenziell für die erythrozytäre Konversion von Pyridoxin zu Pyridoxal. Dadurch erreicht der Organismus eine metabolische Flexibilität, die ihn bis zu einem gewissen Grad unabhängig von der Nahrungsauswahl macht. Zudem können Zellen oder Organe, denen durch das Fehlen der PNPO, die Konversion zu PLP nicht möglich ist, mit PL versorgt werden.
Aus der hohen Reaktivität von PLP mit umliegenden Nucleophilen ergibt sich eine gewisse Problematik für die Zelle im Umgang mit freiem PLP. So liegt der Großteil des erythrozytären PLPs gebunden an Proteine (vor allem Hämoglobin) vor. Anhand von Filtern (MWCO, 3000) ließ sich zwischen der hier definiert als „freien“ und der „gebundenen“ Form von PLP differenzieren. So konnten erste Erkenntnisse zur Rolle von PDXP als Determinator freier PLP-Konzentrationen in Erythrozyten und insbesondere im Hippocampus erlangt werden. Im Hippocampus ergaben sich insgesamt deutlich höhere Konzentrationen an freiem PLP als in den Erythrozyten und es bestand zudem ein Unterschied zwischen den Genotypen. So wiesen die KO-Mäuse ~1/3 höhere freie PLP-Konzentrationen im Vergleich zu den Wildtypen auf. Schließlich konnte ein Effekt des Tieralters auf den PLP-Metabolismus festgestellt werden. Sowohl in den Erythrozyten als auch im Hippocampus ergaben sich alterskorrelierte Änderungen ihrer PLP-Konzentrationen. Zudem zeigten Western Blot Analysen altersbedingte Unterschiede ihrer Vitamin B6-Enzymexpressionen. So wiesen ältere Wildtypen im Hippocampus eine fünffach erhöhte PDXP-Expression verglichen mit jüngeren Tieren auf. In den Erythrozytenlysaten hingegen zeigten ältere Tiere beider Genotypen eine rund vierfach geringere PNPO-Expression gegenüber jüngeren Tieren. Die mit dem Alter eintretende physiologische Verringerung der erythrozytären PNPO-Expression würde somit für den Organismus einen Verlust seiner metabolischen Flexibilität bedeuten, die mit der Konversion von PN zu PL einhergeht.
Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen.
Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern.