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In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln über die Kernhülle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell möglich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst kürzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40% und 30% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30% Membranfraktion, welche für die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenförmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellulären Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults könnten womöglich eine Rolle als Transporter über die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zelluläre Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit näher untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zunächst die 40% und 30% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernhülle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30% Membranfraktion assoziierte MVP für die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem löste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und führte zur Messung von Strömen durch Einzelkanalmessungen über die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgeführt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine frühere Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40% und 30% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernhülle ebenfalls Abhängig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abhängig vom Transport von MVP zur Kernhülle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch benötigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfläche gerichtet sind, sollten für den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden.
Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren.
Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.
HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.