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Zusammenfassung Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozeß, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der ORC-Komplex an Replikationsorigins in chromosomaler DNA, wodurch die Assemblierung des präreplikativen Komplexes an den Origins ausgelöst wird. Anschließend lagern sich CDC6- und RLF-B/CDT1-Protein an den ORC an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase wird der Origin lizensiert, nachdem der letzte Initiationsfaktor CDC45 die Assemblierung des pre-RC vervollständigt hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Proteininteraktionen zwischen den verschiedenen Initiationsproteinen durch Two-Hybrid-Studien aufzuklären. Dazu wurden die cDNAs aller bisher in Mus musculus charakterisierten Initiationsproteine, wie ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, der "polo like kinase" CDC5/PLK, des DNA-Einzelstrang-bindenden Replikationsproteins RPA mit seinen Untereinheiten RPA14, RPA32, RPA70 und schließlich des heterodimeren Proteins Ku mit den Untereinheiten Ku80 und Ku70 jeweils in zwei verschiedene Hefevektoren inseriert. Zum einen handelt es sich dabei um den Ködervektor pEG202 und andererseits um den Beutevektor pJG4-5 des Two-Hybrid-Systems. Dabei wurden alle möglichen Köder-/Beute-Proteinkonstellationen auf eine Aktivierung des Reportergens LacZ hin untersucht und so zahlreiche Protein-Proteininteraktionen identifiziert. Einige der hier beschriebenen Wechselwirkungen waren auch in anderen Spezies identifiziert worden und konnten somit für Maus bestätigt werden. Im Rahmen dieser Two-Hybrid-Untersuchungen wurden allerdings auch erstmals neue Protein-Proteininteraktionen nachgewiesen, wie beispielsweise CDC5/PLK mit MCM2 oder Ku80 mit ORC1, -2, -4 und -5. Sowohl von CDC5/PLK- als auch von Ku80-Protein wurde vermutet, daß sie im Zusammenhang mit der Initiation der DNA-Replikation stehen könnten. Die Two-Hybrid-Interaktionen hier vermittelten neue Indizien, die diese Vermutung untermauern. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden fünf CDC7-Deletionsmutanten konstruiert, um die Interaktionsdomänen des CDC7-Proteins mit anderen Proteinen im Rahmen des Two-Hybrid-Systems bestimmen zu können. Die Mutanten wurden dazu jeweils in den pEG202- und den pJG4-5-Hefevektor inseriert. Die Hefe-Studien wurden nur mit denjenigen Proteinen durchgeführt, mit denen das CDC7-Wildtyp-Protein im ersten Teil der Arbeit positive Interaktionen eingegangen war. Auffallend bei den Untersuchungen mit den Deletionsmutanten war, daß sie in der Köderposition mehr Interaktionen eingingen als in der Beuteposition. Nur die C1-, C2- und N2-Mutante gingen noch Wechselwirkungen mit einigen Initiatorproteinen ein, während weder die C2- noch die N1-Mutante dazu in der Lage waren. Als Resultat dieser CDC7-Interaktionsdomänenkartierung stellte sich das Kinase-Insert II als ein für die Mehrheit der Protein-Proteininteraktionen des CDC7-Proteins zentrales Element heraus. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war es, paradigmatisch einzelne Protein-Proteininteraktionen, die in den Two-Hybrid-Studien aufgefunden worden waren, mittels einer zweiten Methode zu analysieren. Zusätzlich sollte die Zellzyklusabhängigkeit einzelner Interaktionen der an der Initiation der DNA-Replikation beteiligten Proteine untersucht werden. Dazu wurden Immunpräzipitationsversuche mit synchronisierten FM3A-Mauszellen durchgeführt. Die in Suspensionskultur kultivierten Mauszellen wurden mit Mevastatin in früher G1-, mit Mimosin in G1/S-, mit Hydroxyharnstoff in der S- und mit Nocodazol in der Mitose arretiert. Ausgangsbasis für die weiteren IP-Experimente waren aus den FM3A-Zellen präparierte Kernextrakte. Folgende Antikörper wurden zur Inkubation mit Kernextrakten verwendet: gegen ORC1-, ORC2-, ORC3-, ORC5-, ORC6-, CDC6-, MCM2-, MCM7- und DBF4 gerichtete Antikörper. Mit allen genannten Antikörpern konnten Immunpräzipitationen zwischen einzelnen ORC-Untereinheiten, CDC6- und ORC-Proteinen, einzelnen MCM-Untereinheiten und ORC2- bzw. CDC6-Protein und zwischen der regulatorischen Untereinheit der DDK-Kinase DBF4 und einigen ORC-Untereinheiten nachgewiesen werden. Ein großer Teil der IPs trat in zellzyklusunabhängiger Weise auf, während ein kleinerer Anteil Zellzyklusabhängigkeit zeigte, wie beispielsweise die CDC6-ORC2-Wechselwirkung, die nur von der frühen bis zur späten G1-Phase beobachtet werden konnte. Im vierten und letzten Abschnitt dieser Arbeit ging es um die Identifizierung eines Maus-EST-Klones für das CDT1-Gen. Das CDT1-Protein ist essentieller Bestandteil der Initiation der DNA-Replikation und sorgt gemeinsam mit dem CDC6-Protein für die Rekrutierung des MCM-Komplexes an den Origin, wodurch der präreplikative Komplex für die anstehende Initiation der DNA-Replikation lizensiert wird. Der vollständige Maus-EST-Klon wurde mittels einer Sonde durch radioaktive Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von 9 Tage alten Mausembryonen identifiziert und charakterisiert. Die vollständige Sequenz von MmCDT1 ergab einen offenen Leserahmen von 1673bp und kodiert für ein Protein mit 557 Aminosäuren und einer Molmasse von 61.5 kDa.
Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kanälen, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK ließ mögliche Inter-aktionen mit zellulären und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-führung dreier „Yeast-Two-Hybrid“-Screens zur Identifizierung möglicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abklärung übrig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschlüsse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid“-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abhängigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher könnten beide in Punkt 1.5.4. erwähnten Theorien der Aktivitätsänderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kanäle bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kanälen in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 verändern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint für eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele über den möglichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und näher erläutert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschlüsse über Aktivitätsänderungen des ATP-ab-hängigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren.