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Weltweit sind über 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert, täglich steigt die Zahl weiter an. Es liegt auf der Hand, dass die Forschung zur Bekämpfung der Replikation des Virus stetig weiter geführt werden muss. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen für einen neuartigen HIV-Therapieansatz geschaffen. Dabei steht nicht die Hemmung von Replikations-essentiellen Enzymen wie Protease, Reverse Transkriptase oder Integrase im Vordergrund, sondern die Aufrechterhaltung des humanen retroviralen Schutzes. Durch Hemmung der vif–Elongin-C-Interaktion mit Elongin-C-Inhibitoren bleibt der Organismus in der Lage, sich mithilfe von APOBEC3G auf natürlichem Wege vor dem HI-Virus zu schützen, unabhängig von viralen Mutationen. Aufgrund der Tatsachen, dass die Kristallstruktur von Elongin-C und der Bindemodus von vif in der essentiellen Bindetasche des Proteins aufgeklärt sind, konnten durch Docking-Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christoph Sotriffer in-silico Substanzen bestimmt werden, die theoretisch mit hoher Affinität in die Bindetasche binden und so vif aus dieser verdrängen. Basierend auf diesen Docking-Studien wurden im Rahmen dieser Arbeit ca. 50 potentielle Inhibitoren synthetisiert und weitere 27 Substanzen kommerziell erworben. Diese wurden anschließend zum größten Teil in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Axel Rethwilm in einer zellulären Testvariante auf Hemmung des APOBEC3G-Abbaus getestet. Dabei erwies sich die Substanz A19 (FM329, Abb. 7.1) als sehr effektiv. Zur Bestätigung dieses Testergebnisses wurde A19 weiterhin in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jochen Bodem auf Hemmung der Replikation der Viren untersucht. Auch hier hemmt A19 die Replikation des Virus bei einer Konzentration von 30 µM zu 100%. Da allerdings die Hemmung des Abbaus von APOBEC3G bzw. der Replikation des Virus kein Nachweis auf die tatsächliche postulierte Interaktion zwischen dem Inhibitor und der Bindetasche des Proteins ist, wurde im weiteren Verlauf versucht diese Interaktion nachzuweisen. Dazu wurde zunächst unter Anleitung von Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Dr. Caroline Kisker das Targetprotein exprimiert und isoliert. Damit konnten erste Versuche zur Bindungsaufklärung durchgeführt werden. Diese beliefen sich auf Mikrokalorimetrie-Experimente und Surface-Plasmon-Resonance Untersuchungen. Erste Indizien für eine Wechselwirkung zwischen dem Inhibitor und dem Protein konnten damit bereits ermittelt werden, ein eindeutig positives Ergebnis wurde allerdings noch nicht erzielt.
Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen.
RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008). Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif
verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt (Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration).
Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet. Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken. Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM).
Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier
wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis
wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM). Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch
unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen.
Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen.
RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008).
Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt
(Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration).
Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet.
Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken.
Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM). Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis
wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM).
Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen.